基于ITS2序列探讨兰属的DNA条形码鉴定和系统发育关系

巫伟峰，陈孝丑，陈发兴，陈 春，张毅智

(1.福建省林业科技试验中心，福建 南靖 363600； 2.贵州省植物园，贵州 贵阳 550000； 3.福州植物园，福建 福州 350000； 4.福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350000)

兰属(Cymbidium)是兰科(Orchidaceae)植物中最著名且分布范围最广的一类[1]，全世界约有70种，中国约有49种[2]。因其具有独特的美学魅力和文化雅趣，古往今来深受文人墨客的青睐，具有极高的观赏和经济价值，特别是春兰、建兰、墨兰等国兰系列。近年来，随着兰花产业的不断发展，兰属种质资源数量逐年上升，包括原种、变种、杂交种、栽培品种或品系等类型，数量繁多，加之自然状态下兰属植物种间杂交结实易发，且其自身容易发生变异，导致种间类型多、种间界限模糊[3]，大大增加了兰属植物分类鉴定和开发利用的难度。迄今为止，基于形态学标记建立的分类系统仍是兰属分类鉴定的主要依据[4]。但受个体发育、营养差异等因素影响，特别是在非生育期，同类型兰花形态特征十分相似，要求鉴定者具有丰富的实践经验和专业知识，在实际应用中有很大局限性。因此，探寻一种快速、便捷、有效的分类鉴定策略十分必要，对兰属植物的物种鉴定、分子系统学等研究意义重大。

DNA条形码(DNA barcoding)是利用基因组中一段公认标准的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断技术，该概念自加拿大分类学家Hebert[5]首次提出后，便受到各国科学家的广泛关注，是目前植物分子系统学和鉴定学的研究热点。相比传统形态学鉴定方法，该技术可以避免非遗传形态差异或趋同导致的物种鉴定误差，不受鉴定对象的环境、个体发育和主观臆断等因素的制约[6]，仅需少量组织材料即有可能实现物种的分类识别。迄今，被提议的条形码主要有COⅠ、rpoB、rpoC1、matK、rbcL、trnH-psbA、atpF-atpH、psbK-psbI、ITS、ITS2等核酸片段[7]。部分动植物已建立了较成熟的DNA条形码鉴定技术体系，如基于ITS2的中草药鉴定体系[7]、基于COⅠ的药用动物鉴定体系[8]。2011年中国植物条形码研究组通过对1 757种植物的psbA-trnH、ITS/ITS2、rbcL+matK序列或序列组合进行鉴别能力评价，提出将ITS/ITS2序列作为种子植物的核心条形码[9]。2014年，Chen等[10]通过对trnH-psbA、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2和ITS共7个候选序列的扩增成功率、种内种间变异，以及Barcoding gap三方面进行比较分析，发现ITS2的表现最为突出，同时利用6 600份共753属4 800种的植物样本对ITS2的鉴定能力进行评估，结果显示，ITS2在物种水平的鉴定成功率达到92.7%，因此，提出将ITS2序列作为药用植物通用DNA条形码序列。ITS2是真核生物核糖体DNA上的一段顺反子，位于5.8S和26S的基因内转录间隔(ITS)区[11]，它在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，在物种间具有显著性差异[12]，已被广泛应用于物种分类和系统进化研究[7]。至今，ITS序列在兰属的分类鉴定研究中仍鲜见报道。因此，本研究运用12个本地兰属样品(2个建兰、3个春兰、4个墨兰、2个春剑、1个莲瓣兰)、81条GenBank数据库下载的兰属ITS2序列和169条其他兰科ITS2序列样本，通过BLAST1、遗传变异、建树法等分析，评估了ITS2序列用于兰属植物分子鉴定的应用潜力，并基于建树结果探讨了兰属植物的系统发育关系，旨在为兰属植物的快速鉴定、分子系统学研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

12份兰属本地样品取自福建省林业科技试验中心兰花种质资源圃，通过形态学鉴定分别为建兰(C.ensifolium)(复兴奇蝶、铁骨水晶)、春兰(C.goeringii)(翠一品、宋梅、汪字)、墨兰(C.sinense)(彩龙梅、青达摩、十八娇、阳明锦)、春剑(C.goeringiivar.longibracteatum)(隆昌素、西蜀道光)、莲瓣兰(C.tortisepalum)(碧龙玉素)。根据刘仲健等[13]的《中国兰属植物》分类，除莲瓣兰为建兰亚属无关节组外，其余样品均属于建兰亚属建兰组。取样时，要求选择无病虫害的幼嫩叶片，使用70%乙醇对叶片表面进行表面清洁；取样后，使用液氮速冻，置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。另外，以GenBank下载的250条兰科ITS2序列作为参考库，其中包含81条兰属ITS2序列信息，具体见表1(分类参照《中国兰属植物》)，169条其他兰科ITS2序列信息，见表2(分类参照《中国植物志：兰科》[14])。

1.2 总DNA提取

称取0.1 g叶片，用组织研磨仪(浙江托普YMY-200)研磨成粉末，使用北京天根高效植物总DNA提取试剂盒(DP350-03)提取基因组DNA，按照试剂盒说明书中操作步骤进行。

表1 GenBank下载的81条兰属ITS2序列信息

Table 1 Informations of 81 ITS2 sequences ofCymbidiumdownloaded from GenBank

亚属Subgenus组Section种Species兰亚属兰组CymbidiumC. aloifolium (gi21427016, gi387234507, gi11182031, gi332693261), C. bicolor (gi21427017)Cymbidium带叶组HimantophyllumC. dayanum (gi21427018)多花组FloribundaC. floribundum (gi21427020, gi22087073, gi21427019),C. suavissimum (gi21427021, gi22087072)南兰组AustrocymbidiumC. madidum (gi22087074)福兰组BigibbariumC. devonianum (gi332693252)大花兰属Cyperorchis大花组IridorchisC. tracyanum (gi21427022), C. giganteum (gi332693260), C. insigne (gi21427028, gi11182032), C. erythraeum (gi21427024), C. hookerianum (gi332693257, gi21427025), C. wilsonii (gi21427026), C. iridioides (gi21427023), C. lowianum(gi332693254, gi11182033, gi21427027)腋花组EburneaC. mastersii (gi332693253, gi21427032), C. eburneum (gi332693259, gi21427031, gi21427030)红柱兰组AnnamaeaC. wenshanense (gi21427029)莎草兰组CyperorchisC. elegans (gi332693256, gi21427033), C. cochleare (gi387234509)斑舌兰组ParishiellaC. tigrinum (gi21427034, gi332693255)建兰亚属地生腋花组AxillariaC. cyperifolium (gi332693258, gi21427040)Jensoa建兰组JensoaC. sinense (gi22087084, gi21427035, gi21427036, gi11182034, gi229609532), C. ensifolium (gi22087079, gi21427037, gi21427038, gi229609531, gi11182035), C. goeringii (gi532734669, gi532734613, gi532734693, gi11182045, gi532734579, gi532734608, gi532734564, gi532734707, gi532734594, gi532734679, gi532734645, gi532734657, gi532734624, gi532734634, gi21427043, gi11182050, gi11182051), C. kanran (gi21427041, gi11182043, gi11182042, gi11182041), C. defoliatum (gi21427039), C. gyokuchin (gi11182039, gi11182038, gi11182040), C. forrestii (gi11182049), C. rubrigemmum (gi11182046)无关节组NanulaC. faberi (gi21427042, gi11182037), C. tortisepalum (gi21427044)兔耳兰组GeocymbidiumC. lancifolium (gi21427045, gi11182047, gi11182048)

表2 GenBank下载的169条其他兰科ITS2序列信息

Table 2 Informations of 169 other ITS2 sequences of Orchidaceae downloaded from GenBank

族Trib name属Genus name种名与GenBank gi编号Species name and GenBank gi number树兰族Epidendreae香荚兰属VanillaV. pompon(gi260401086, gi260401089, gi260401087, gi260401088), V. hybrid_cultivar (gi260401123, gi260401124, gi260401126, gi260401122), V. planifolia (gi260401091, gi260401092, gi260401094, gi260401095)虾脊兰属CalantheC. arisanensis (gi58397781), C. aristulifera (gi58397782), C. triplicate (gi58397791, gi667794530), C. sylvatica (gi58397787, gi71142907, gi78126136, gi78126133, gi78126134, gi78126135, gi58397783), C. alismifolia (gi58397792)带唇兰属TainiaT. cordifolia (gi667794539, gi667794540), T. macrantha (gi667794544), T. dunnii (gi667794541), T. minor (gi667794545), T. latifolia(gi667794542), T. longiscapa (gi667794543)足柱兰属DendrochilumD. dewindtianum(gi3386434, gi12659072), D. muluense(gi3386431), D. acuiferum(gi14719229, gi14719232, gi14719230, gi14719231), D. lancilabium(gi3386437), D. longira-chis(gi3386450), D. lacteum(gi3386452), D. glumaceum(gi3386440, gi6652550)石斛属DendrobiumD. amoenum(gi300250529, gi695130324, gi300250531), D. aqueum(gi300250557, gi300250558, gi334382045), D. aphyllum(gi307000564, gi523586035, gi690376796), D. adun-cum(gi334382043, gi371945779, gi545669923), D. barbatulum(gi300250559, gi300250560, gi300250561)兰属Cymbidium见表1(不包含在169条其他兰科ITS2序列内)Listed in table 1 (not included in 169 other Orchidaceae ITS2 sequences)万代兰族Vandeae拟万代兰属VandopsisV. lissochiloides(gi60499606, gi84578765, gi71912908), V. gigantea(gi158534793), V. undulata(gi387234753, gi387234754)槽舌兰属HolcoglossumH. amesianum (gi339779444, gi339779445, gi194270885), H. flavescens (gi194270900, gi194270901, gi194270902), H. lingulatum (gi194270886, gi339779461), H. linearifolium (gi354685622), H. kimballianum (gi158534776, gi126789464)万代兰属VandaV. tricolor (gi158534790, gi158534791, gi158534792), V. luzonica (gi71912899, gi37958083), V. pumila (gi158534789, gi194270909, gi84578762), V. coerulescens (gi60499605, gi194270910), V.testacea (gi387234751, gi387234749, gi387234750), V.flabellata (gi71912894, gi84578696, gi158534787)蝴蝶兰属PhalaenopsisP.sumatrana (gi37622247, gi37622249, gi37622251), P.tetraspis (gi27464723, gi60499591), P.violacea (gi38260591, gi38260597, gi37958072), P.bellina (gi38260600, gi38260601, gi58825879), P.wilsonii (gi71912891, gi84578743, gi27464741), P. viridis (gi29501545, gi60499593, gi60499595), P. stuartiana (gi27464706, gi60499590, gi37958080), P. amabilis (gi37223369, gi37223370, gi37223381), P. sanderiana (gi37223405, gi37223406, gi37223407), P. Aphrodite (gi37223390, gi37223393, gi37223395), P. taenialis (gi37958017)兰族苞叶兰属BrachycorythisB. henryi (gi1321101765), B. obcordata (gi1321101766)Orchideae红门兰属OrchisO. adenocheila (gi1143631384, gi1143631388, gi1143631385, gi1143631386, gi1143631387), O. mascula (gi1026286784, gi1143631377, gi1143631375, gi1143631376, gi1143631374, gi1026286793, gi1026284564, gi1143631378, gi1143631379)手参属GymnadeniaG. conopsea (gi407894520, gi410112222, gi87294839, gi393192826), G. odoratissima (gi730046224, gi730046223, gi730046220), G. orchidis (gi1284844394), G.frivaldii(gi87294838, gi87294835), G.rhellicani (gi730046207)鸟巢兰族翻唇兰属HetaeriaH. affinis (gi987894312), H. youngsayei (gi987894314)Neottieae绶草属SpiranthesS. casei (gi1331391947, gi1331392205, gi1331392818, gi1331392982, gi1331392761), S. cer-nua (gi11528348)头蕊兰属CephalantheraC. damasonium (gi37720891), C. longifolia (gi37720892), C. rubra (gi37720890)鸟巢兰属NeottiaN. cordata (gi1026285580, gi1026285720, gi1026286937, gi1331391997), N. nidus-avis (gi1026285435, gi1026286977), N. ovate (gi1026286831, gi1026287059, gi1331392422, gi1331393060)

1.3 ITS2序列扩增与测序

PCR反应程序在高连明等[15]的《关于植物DNA条形码研究技术规范》基础上进行了适当修改。PCR反应体系20μL∶10 μL 2×TaqMaster Mix，1 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，无菌水8 μL。引物序列[16]：S2F(5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’)，S3R(5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’)，委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成。PCR反应(BIO-RAD T100TMPCR仪)程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。采用质量体积分数1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测。PCR扩增产物经TIANGEN DNA纯化回收试剂盒(DP214-03)纯化后，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。

1.4 数据分析

测序峰图采用CodonCode Aligner V2.06(CodonCode.， USA)序列拼接软件校对拼接。序列质量评价判断方法参照国际DNA条形码协会(CBOL)的通用标准[17]。将拼接得到的一致序列和GenBank下载的参考序列基于隐马尔可夫模型HMMer真核生物注释方法，去除序列两端5.8S和26S区段，获得ITS2间隔区序列[18]。通过ITS2条形码数据库网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)进行BLAST1鉴定。用MEGA 7进行多序列比对、GC含量、遗传变异等分析，并计算K2P遗传距离，基于最大似然法(maximum likelihood， ML)和邻接法(neighbor-joining， NJ)构建系统发育树，插入/缺失不视为信息位点，以“missing data”处理，缺隙(gap)设置为完全缺失(complete deletion)，用自展法(bootstrap)进行重复1 000次支持率检测，评估系统发育树各分支的可靠性。Barcoding gap检验作图分析采用Graphpad prism 7.0软件。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增与测序结果

如图1，利用ITS2序列引物S2F和S3R，在12个样品中均扩增出目的条带，特异性良好，扩增成功率为100%。表明该引物具有良好的通用性。

M, DNA标准分子质量；1，建兰复兴奇蝶；2，建兰铁骨素梅；3，春兰翠一品；4，春兰宋梅；5，春兰汪字；6，墨兰彩龙梅；7，墨兰青达摩；8，墨兰十八娇；9，墨兰阳明锦；10，莲瓣兰碧龙玉素；11，春剑隆昌素；12，春剑西蜀道光。M, DNA standard molecular weight; 1， C. ensifolium Fuxingqidie; 2， C. ensifolium Tiegusumei; 3， C. goeringii ‘Cuiyipin’; 4， C. goeringii Songmei; 5， C. goeringii Wangzi; 6， C. sinense Cailongmei; 7， C. sinense Qingdamo; 8， C. sinense Shibajiao; 9， C. sinense Yangmingjin; 10， C. tortisepalum Bilongyusu; 11， C. goeringii var. Longibracteatum Longchangsu; 12， C. goeringii var. Longibracteatum Xishudaoguang.图1 12个兰属样品的ITS2序列PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplification electrophoresis of ITS2 sequences from 12 Cymbidium samples

2.2 序列特征与鉴定效率

基于隐马尔可夫模型对ITS2序列(包括本研究样品和所有GenBank下载序列)进行HMMer注释，获得的ITS2序列长度介于222～271 bp，平均长度为255.9 bp。(G+C)含量介于46%～77%，平均(G+C)含量为63%。利用BLAST1鉴定方法对12个样品进行鉴定，结果如表3所示，在属、亚属水平的鉴定成功率均为100%，组水平的鉴定成功率为92%，而种水平鉴定成功率仅17%。

2.3 遗传变异分析

K2P遗传距离计算结果显示：属内变异为0.064，属内最大K2P遗传距离为0.187；属间变异为0.842，属间最小遗传距离为0.057；亚属内变异为0.101，最大亚属内遗传距离为0.137；亚属间变异为0.125，最小亚属间遗传距离为0.106；组内变异为0.740，最大组内遗传距离为0.165，组间变异为0.113，最小组间遗传距离为0.014；种内变异为0.128，最大种内遗传距离为0.340，种间变异为0.121，种间最小遗传距离为0。Barcoding gap检验结果(图2)显示，属间变异和属内变异分布存在明显的gap(图2-A)，属间差异明显大于属内差异。组内变异和组间变异、种间变异和种内变异均没有明显的gap(图2-B、2-C)，存在较大重叠。遗传变异位点计算结果显示，81条兰属参考序列共检测到遗传位点279个，变异位点有209，变异率为74.9%。可见，兰属ITS2序列具有很高的遗传多样性，在亚属水平上尚能较好地区分开，由于高变异率，组内变异和组间变异、种内变异和种间变异的分布没有明显界限，导致对兰属的组、种水平区分不准确。

表3 12个样品的BLAST1鉴定结果

Table 3 BLAST1 identification results of 12Cymbidiumsamples

样品名Sample name种名Species属Genus亚属和组Subgenus and section种Species宋梅 SongmeiC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran 汪字 WangziC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran 翠一品 CuiyipinC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran, C. goeringii隆昌素 LongchangsuC. goeringii var. longibracteatumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. goeringii var. Longibracteatum西蜀道光XishudaoguangCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. goeringii 青达摩 QingdamoC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi十八娇 ShibajiaoC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi彩龙梅 CailongmeiC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi阳明锦 YangmingjinC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi碧龙玉素 BilongyusuC. tortisepalumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran铁骨水晶 TiegushuijingC. ensifoliumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi复兴奇蝶 FuxingqidieC. ensifoliumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi鉴定成功率100100,9217Identificationsuccess rate/%

2.4 建树分析

A，250条参考库序列的属内和属间Barcoding gap检验图；B，兰属参考库序列的组内和组间Barcoding gap检验图；C，兰属参考库序列的种内和种间Barcoding gap检验图。A， Intra-and inter-generic Barcoding gap test diagram of 250 sequences from reference database; B， Intra-and inter-section Barcoding gap test diagram of Cymbidium sequences from reference database; C， Intra-and inter-species Barcoding gap test diagram of Cymbidium sequences from reference database图2 Barcoding gap检验图Fig.2 Barcoding gap test diagram

利用NJ法对兰属ITS2序列进行建树分析，结果如图3。由图3-A的一致树可知，在不同分类阶元均获得一些有效区分(支持率>50%)，如亚属水平上的大花亚属，组水平上的建兰组、大花组、兰组；物种水平上有C.tigrinum、C.floribundum、C.sinense，但12个样品未能获得有效鉴别；表明ITS2序列在兰属亚属、组和物种水平上均具有一定的鉴别能力，但鉴别范围有限，大部分序列在亚属、组和物种水平上仍然未获得有效鉴别。图3-B的原始树结果显示，兰属中的建兰亚属、兰亚属和大花亚属被明显区分开，但不能准确区分组与组下水平；12个样品中，除春兰汪字外，其他均与建兰亚属样本聚在一起。拓扑结构关系表明，建兰亚属与兰亚属亲缘较近，两者与大花亚属亲缘较远。图3-B的灰色方框内显示，莲瓣兰(gi21427044)与8个春兰参考样本(gi532734564、gi532734634、gi532734657、gi532734707、gi532734624、gi532734645、gi532734679、gi532734594)聚在一个分支上(支持率69%)，可见莲瓣兰与春兰之间亲缘关系较近。

基于最大似然法构建所有参试ITS2序列的系统发育树，结果如图4所示。系统发育树被分为4大分支，Cymbidium单独组成分支Ⅰ(87%)，Calanthe(99%)、Dendrobium(63%)、Dendrochilum(98%)、Tainia(88%)组成分支Ⅱ；Hetaeria(98%)、Cephalanthera(77%)、Neottia(80%)、Spiranthes(93%)、Brachycorythis(91%)、Orchis(68%)、Gymnadenia(88%)组成分支Ⅲ；Vanda、Vandopsis、Phalaenopsis、Holcoglossum和Vanilla(100%)组成分支Ⅳ。除Vandopsis外，其他属均在属水平上形成单系分支。根据《中国植物志：兰科》的分类学划定，组成分支Ⅰ和分支Ⅱ的属均属于树兰族；分支Ⅲ中，Hetaeria、Cephalanthera、Neottia、Spiranthes4个属为鸟巢兰族，Brachycorythis、Orchis、Gymnadenia属于兰族；分支Ⅳ中，Vanda、Vandopsis、Phalaenopsis、Holcoglossum4个属为万代兰族，Vanilla属于树兰族。系统发育树的拓扑结构与传统系统学大体一致，12个兰属样品都聚在Cymbidium分支，与形态学鉴定结果一致。

3 讨论

3.1 ITS2序列鉴定兰属植物的应用潜力

理想的条形码种间遗传变异应明显大于种内，并在两者之间存在Barcoding gap[7]。ITS2序列作为分子系统进化研究中最重要的标记之一，在物种水平或种下水平具有明显的序列变异[7]，是鉴别物种水平或种下水平的重要候选条形码之一。本研究结果显示，ITS2序列在兰属植物的属水平、亚属水平上具有较好的鉴别能力，而组和物种水平虽具有一定的鉴别能力，但鉴定成功率较低，这主要与兰属植物ITS2序列的高变异率有关。因此，我们认为ITS2序列适合作为兰属植物DNA条形码鉴定分析的辅助条形码。

3.2 莲瓣兰与春兰的分类关系

在分类学上，莲瓣兰的归属问题一直颇受争议，是独立种还是春兰下的一个变种，或者只是春兰的品种，一直未有定论[19]。1980年，吴应祥等[20]将莲瓣兰作为春兰种下的一个变种。1991年，吴应祥[21]又将莲瓣兰从春兰中分出，与春兰一起作为蕙组小花亚组下的一个种。莲瓣兰和菅草兰是极为相似的植物，《中国植物志：兰科》将莲瓣兰划为菅草兰的一个品种。由于春兰叶的下部有关节，花序通常只具一朵花，而莲瓣兰叶的下部无关节，花序通常具3～5朵花，刘仲健等[13]将莲瓣兰从春兰中移出来作为菅草兰下的一个变种。本研究结果显示，莲瓣兰(gi21427044)与8条春兰参考序列(gi532734564、gi532734634、gi532734657、gi532734707、gi532734624、gi532734645、gi532734679、gi532734594)聚在一个有效分支上(支持率69%)，说明春兰与莲瓣兰关系紧密，莲瓣兰可能是春兰下的一个变种或品种。

A，一致树；B，原始树。A， Consensus tree; B， Original tree.图3 基于ITS2序列构建的兰属NJ树Fig.3 Cymbidium NJ tree based on ITS2 sequence

3.3 兰属植物的分类

兰属植物的分类经历了一个艰难的发展过程，存在诸多不同版本的分类系统，在已发表的若干分类系统中，比较常见的有文献[13， 22-25]的分类系统。德国形态学分类学家Shlechter R根据花序、蕊柱、唇瓣等特征将兰属植物分为8组[22]，除澳洲兰组和二叶兰组外，无叶兰组、地兰组、春兰组、建兰组、东凤兰组、真兰组6组都有我国的兰花。吴应祥等[20]以属下体态、习性、苞片的长短，以及蕊柱长短等特征为依据，在Hunt[23]系统的基础上把Shlechter[22]和Hunt[23]所承认的8个组合并为6组，分别为长苞组、短苞组、长柱组、垂花组、宽叶组和腐生组。Du Puy等[25]在其编著的《The GenusCymbidium》中将全世界兰属植物44个种分为3个亚属15组，其中，分布在我国的兰属有10组22种。之后，《中国兰花全书》[26]、《中国植物志：兰科》[14]、《中国兰属植物》[13]等著作中均认为Du Puy & Cribb系统[25]比较自然和现代，在该系统基础上进行完善与增补。本研究的兰属ITS2序列建树分析结果显示，绝大部分的ITS2序列都能按照所属亚属被明显区分开，这从分子水平进一步支持了Du Puy & Cribb系统的3亚属分类观点。

综上所述，ITS2序列可以为兰属植物的分子鉴定、亲缘关系、系统发育关系等研究提供有价值的参考，但鉴于ITS2在兰属的组或组下水平鉴别能力较弱，我们建议将其作为兰属植物DNA条形码鉴定的辅助条形码。

图4 基于最大似然法与ITS2序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on maximum likelihood method and ITS2 sequences