湖南地区结直肠癌中错配修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达与临床病理特征的关系

吴畅　张继君　赵夫娟　王俊普　文继舫

【摘要】 目的：探讨错配修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2在结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）组织中的表达及其临床病理意义。方法：应用免疫组化PV法检测结直肠癌组织（191例）中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达情况，将4种MMR蛋白中的1种及以上表达缺失判定为错配修复基因缺陷（dMMR），全部阳性判定为错配修复基因完整（pMMR），并分析其与临床病理特征的关系。结果：（1）191例中pMMR组159例，MMR蛋白表达率83.2%，dMMR组32例，MMR蛋白缺失率为16.8%。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达缺失率分别为2.6%、2.6%、8.9%及14.7%;其中共同缺失表达类型为MSH2-MSH6、MLH1-PMS2及4种共同缺失者分别为4例（2.1%）、14例（7.3%）、2例（1.0%）。（2）CRC癌患者dMMR与pMMR在肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度等临床病理特征方面比较，差异均有统计学意义（P<0.05），而在性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯和神经侵犯等方面比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：MMR蛋白与CRC临床病理特征关系密切。MMR蛋白对预测CRC的恶性程度、临床预后及发病机制方面可能有指导意义。

【关键词】 结直肠癌; MSH2; MSH6; MLH1; PMS2; 免疫组织化学

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mismatch repair protein（ MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2）with clinicopathological features in colorectal cancer.Method：The expression of mismatch repair protein MLH1，MSH2，MSH6 and PMS2 were determined by immumohistochemistry in 191 cases of CRC.Deletion of one or more of the four MMR proteins were identified as mismatch repair gene defects（dMMR），and all positives were mismatch repair gene integrity（pMMR），their relationship with clinicopathological features was analyzed.Result：Negative staining of MMR proteins was found in 32 cases analyzed.The frequency of loss expression in MSH2，MSH6，MLH1and PMS2 was 2.6%，2.6%，8.9% and 14.7% respectively.Among them，double proteins absence were found in MSH2/MSH6 in 4 cases（2.1%）and MLH1/PMS2 in 14 cases（7.3%）.There 2 cases（1.0%）with 4 protein deletion.Patients with dMMR and pMMR in CRC had difference in tumor location，tumor diameter and degree of differentiation（P<0.05），but had no obvious difference in gender，age，invasion depth，lymph node metastasis，vascular invasion and neurological invasion（P>0.05）.Conclusion：There is a close relationship between MMR proteins and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer.MMR proteins may be biological indicators for estimating malignant degree，clinical prognosis and pathogenesis mechanism of CRC.

【Key words】 Colorectal cancer; MSH2; MSH6; MLH1; PMS2; Immunohistochemistry

First-authors address：Shenzhen Sixth Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.13.028

結直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是世界范围内常见的恶性肿瘤，因其在癌症进展后预后不良导致的高死亡率，使其成为癌症相关死亡的第二大原因[1-3]。全世界每年新发病例估计有140万例，死亡病例为693 900例。在中国，CRC死亡率在恶性肿瘤死亡率中排名第五，严重危害人类健康[4]。据报道，多种危险因素导致结直肠癌的发生，如不健康的饮食，肥胖和吸烟。尽管早期CRC患者的5年生存率约为90%，但只有39%的病例在早期被诊断出来。当其扩散到远处器官时，5年生存率下降到12.5%[5]。临床的挑战是能够在早期识别CRC患者，从而选择更为合适的治疗方案。因此深入了解参与CRC侵袭和转移的相关分子机制十分必要，具有重要的临床意义。结直肠癌是一个复杂的，多步骤的过程，由多因素、多信号通路和多种基因突变导致。约15%的结肠癌是由DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因缺陷所致。DNA错配修复系统的主要功能在于修复那些在DNA复制过程中逃脱DNA聚合酶即时校读的错配碱基，以维持基因组的稳定性和避免细胞突变，从而间接抑制肿瘤的发生[6]。越来越多的研究表明人体不同部位的多种不同类型的肿瘤都可能与MMR的表达缺失密切相关。本研究采用免疫组化PV法检测结直肠癌中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达情况，探讨其与结直肠癌临床病理特征的关系，为结直肠癌侵袭转移及预后判断提供客观指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中的所有标本取自2017年1月-2018年11月在中南大学附属湘雅医院确诊并进行手术治疗的结直肠癌患者191例。纳入标准：按照2010版WHO标准经病理检查确诊为原发性结直肠癌;术前未进行放化疗;行肠癌根治术。排除标准：活检标本;免疫组化的资料不完整者。其中男114例，女77例;年龄35～81岁，平均60岁;结肠癌98例，直肠癌93例;有淋巴结转移者69例，无淋巴结转移者122例;分化程度：高分化腺癌18例，中分化腺癌147例，低分化腺癌26例;肿瘤直径：<5 cm者109例，≥5 cm者82例;浸润深度：T1 + T2共43例，T3 + T4共148例;有脉管侵犯者34例，无脉管侵犯者157例;有神经侵犯者23例，无神经侵犯者168例。该研究已经伦理学委员会批准，患者知情同意。所有标本均经病理检查确诊。

1.2 方法 送检组织经4%中性甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，3 μm厚度切片，HE染色，光镜观察。选取肿瘤与正常组织同时存在的蜡块，4 μm厚度切片行免疫组化，采用Envision法，一抗为MSH2、MSH6、MLH1及PMS2，抗体及所用免疫组化试剂均购于福州迈新生物技术开发有限公司，操作步骤按照试剂说明书进行。以上操作均用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，每例都有HE切片做对照观察。

1.3 结果判定 阳性结果明确，阳性信号的位置正确且染色特征正确。MLH1、MSH2、MSH6及PMS2均定位于细胞核。对照组织即肿瘤周围的正常上皮细胞、肿瘤内浸润的淋巴细胞、间质细胞均出现细胞核着色，可作为内对照[7]。根据文献[3]，阳性结果判定标准为：MMR蛋白在细胞核明确着色表达判定为阳性，与核染色强弱以及阳性细胞弥漫或局灶分布无关;细胞核不着色判断为阴性。将4种MMR蛋白中的1种及以上表达缺失判定为错配修复基因缺陷组（deficent Mismatch Repair，dMMR），全部阳性判定为错配修复基因完整组（proficient Mismatch Repair，pMMR）。

1.4 统计学处理 使用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，计数资料采用率（%）表示，比较采用检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMR蛋白表达情况 4种MMR蛋白表达均定位于肿瘤细胞核，191例CRC中MMR蛋白阳性者（pMMR组）159例（83.2%），表达缺失者（dMMR组）32例（16.8%），其中MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达缺失者分别为5例（2.6%）、5例（2.6%）、17例（8.9%）及28例（14.7%）;MSH2与MSH6共同缺失表达者4例（2.1%），MLH1与PMS2共同缺失表达者14例（7.3%）;4种蛋白共同缺失者2例（1.0%）。

2.2 MMR蛋白表达与CRC临床病理特征的关系 dMMR组与pMMR组相比，在肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度等临床病理特征方面差异有统计学意义（P<0.05），表现为在dMMR组肿瘤直径更大，发生结肠者所占比例多，分化程度更低。而在性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯和神经侵犯等方面比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

CRC是消化道中最常发生的恶性肿瘤之一，对全世界众多患者的健康构成了巨大威胁[8]。CRC患者直到癌症晚期都没有明显的臨床症状是该疾病最常见的标志之一，导致预后不良和高死亡率[9]。虽然在早期能够通过手术，化学疗法或者放射疗法等方式进行治疗，但仅有少数CRC病例可以在早期获得确诊。肿瘤具有快速进展和预后不良的特点，这也是影响CRC治疗的主要问题[10]。

临床上根据结直肠癌的发病特点将其分为遗传性与散发性两种，散发性结直肠癌是最常见的CRC类型。CRC中存在几种分子变化，例如染色体不稳定性（CIN），微卫星不稳定性（MSI）和CpG岛甲基化表型（CIMP）[11]。微卫星是分布在基因组编码区和非编码区的DNA序列的短串联重复序列（STR），由于它们的重复结构而易于导致高突变率。微卫星不稳定性（MSI）是一种从DNA错配修复（MMR）系统中兴起的分子表型。DNA错配修复系统纠正了DNA复制和重组过程中产生的缺失，插入和碱基错配，这些错误已经逃脱了校对过程[12-14]。MMR的缺陷导致全基因组不稳定，特别是在简单的重复序列中（称为MSI）。很多研究指出在结肠，胃，子宫内膜和大多数其他散发性癌症中存在MSI。确定CRC中MSI的状态具有预后和治疗结果。此外，MSI在临床上可用于检测因MMR缺乏引起的种系缺陷的患者，并用于肿瘤诊断和分类[3，11]。

目前免疫组织化学方法已被广泛应用，且报道证实检测MMR基因的可靠性，因此应用免疫组织化学检测MMR基因被医院及科研机构所采用[15]。错配修复蛋白包括MutS和MutL两大家族，其中MutS主要包括MSH2、MSH3和MSH6等，MutL主要包括MLH1、MLH3、PMS1和PMS2等。研究表明具有种系突变的最常见MMR基因是MSH2，MLH1，PMS2和MSH6，担负着对错配位点识别和切除的主要功能，保持基因的稳定性。一种或多种错配修复蛋白的功能缺失可引起MSI，因此，检测错配修复蛋白缺失情况可间接反应肿瘤的MSI状态[16-17]。国家卫生和计划生育委员会颁布的《中国结直肠癌诊疗规范》（2017年版）提出确定为结直肠癌时，推荐检测错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）表达情况。临床试验有可能在现有标准治疗基础上给患者带来更多获益（例如：dMMR或MSI-H患者有可能从免疫治疗获益）[18]。

本研究结果显示，MSH2缺失者占2.6%，MSH6表达缺失占2.6%，MLH1缺失者占8.9%，PMS2缺失者占14.7%，提示这4种蛋白的突变情况与结直肠癌的发生、发展有着密切的相关性。而于静等[19-20]研究结果表明不同地区的散发性结直肠癌患者各缺失蛋白所占的比例有所不同，并且发生突变的基因也有所不同。MSI表达情况在肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度等临床病理特征方面存在差异（P<0.05）。

综上所述，错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）在结直肠癌的临床病理诊断中有重要参考价值，通过检测MMR蛋白表达情况，可以初步判断错配修复基因是否存在缺失，并且能够提示缺失的错配修复蛋白类型，且错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白（MSH2，MSH6，MLH1，PMS2）与肿瘤部位、肿瘤直径、分化程度等临床病理特征方面有一定的关系，从而为患者的预后判断提供一定的参考依据。但由于本研究尚不属于大样本，不具有广泛的代表性，因此具有一定的局限性。有待于更多更大更全面的相关研究，对本研究结果加以验证或进行补充。

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（收稿日期：2019-01-09） （本文编辑：周亚杰）