乳腺癌组织冰冻与否对其常用免疫组织化学结果的影响

陈智慧　谭丽珊　郭慧　马美春

【摘要】 目的：探讨乳腺癌组织冰冻与否对其常用免疫组织化学结果的影响。方法：收集近年来60例乳腺浸润性导管癌根治手术的病理组织蜡块（必须有术中冰冻病理检查），时间为2016年1月-2017年12月，将标本分别对应分类为冰冻组织与冰剩组织，分别制作成冰冻芯片与冰剩芯片，采用免疫组织化学S-P法检测ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53阳性表达情况，并对比术中冰冻病理结果与术后石蜡病理的符合率。结果：冰冻芯片与冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR阳性结果比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。冰剩组织与术后石蜡病理对比，组织学大小≤3 cm符合率93.75%，组织学大小>3 cm符合率100%，两者比较差异有统计学意义（字2=6.398，P=0.011<0.05），整体符合率为95.00%（57/60）。组织学级别上，整体符合率为91.67%（55/60），与冰冻切片相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：乳腺癌组织冰冻会影响乳腺癌标记物的阳性表达，建议病理医师选择冰剩组织进行免疫组织化学染色，从而为患者提供更精准的结果。

【关键词】 免疫组织化学; 冰冻芯片; 乳腺癌组织; 冰剩芯片

【Abstract】 Objective：To discuss the impact of frozen breast cancer tissues on the immunohistochemical analysis results.Method：The pathological tissue paraffin blocks about 60 invasive ductal carcinoma patients underwent the radical operation（the frozen pathological examination was required during surgery）from January 2016 to December 2017 were collected.The specimens of the frozen tissues and remaining frozen tissues were made as the frozen paraffin block and remaining frozen paraffin block.The immunohistochemistry（S-P）method was used to detect the positive rate of estrogen receptor（ER），progesterone receptor（PR），cerbB-2 protein，Ki-67 and P53，the pathological coincidence rate of frozen paraffin block during surgery and postoperative paraffin block after surgery was compared.Result：The positive results of cerbB-2 protein，Ki-67，P53，ER and PR in frozen chips were significantly different from those in frozen chips（P<0.05）.Compared with paraffin pathology after operation，the coincidence rate of histological size ≤3 cm was 93.75%，and that of histological size >3 cm was 100%，there was significant difference between two groups（字2=6.398，P=0.011<0.05），and the overall coincidence rate was 95.00%（57/60）.At histological level，the overall coincidence rate was 91.67%（55/60），which was significantly different from that of frozen section（P<0.05）.Conclusion：The positive expressions of breast cancer markers are affected by the frozen breast cancer tissues.In order to improve the diagnosis accuracy，the pathologist shall take the remaining tissues to do the immunohistochemical staining.

【Key words】 Immunohistochemistry; Frozen paraffin block; Breast cancer tissues; Reaming frozen paraffin block

First-authors address：Shaoguan First Peoples Hospital，Shaoguan 512000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.14.031

乳腺癌在我国妇女中较为高发，发病率占妇女肿瘤的31%。早在20世纪50年代有学者就提出，对于乳腺癌，仅进行手术治疗是不够的，需要进行系统性的辅助治疗[1]。近年来针对cerbB-2等标记物表达的靶向治疗方案在乳腺癌辅助治疗中成为研究热点。当前乳腺癌常用的标记物有雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、细胞增殖抗原标记物（Ki-67）、cerbB-2及P53等，而各种标记物的阳性百分率将直接影响患者的选择用药及预后判断。通常乳腺癌手术会行术中冰冻切片，在送检组织中将选取部分肿物制作冰冻切片（冰冻组织），剩余肿物（冰剩组织）将待冰冻切片完成后一同固定制作组织蜡块用于常规病理诊断。而后，病理科将面临如何选择组织蜡块行免疫组化，冰冻组织还是冰剩组织，以便为患者提供更精准的结果目前鲜有报道。本研究中将采用回顾性研究，采用成熟的组织芯片技术，在同等条件下，对比近年来本科室乳腺癌冰凍组织与冰剩组织对应的常用免疫组化结果。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取60例乳腺浸润性导管癌患者，时间为2016年1月-2017年12月，患者均行乳腺浸润性导管癌根治手术。患者均为女性，年龄35～66岁，平均（56.8±3.3）岁。纳入标准：未发生远处转移;术前未进行过放化疗。排除标准：合并其他肿瘤;有精神病史。该研究已经伦理学委员会批准。

1.2 方法 由副主任医师及以上职称人员进行取材或指导取材，选取可疑病变处进行取材，所有标本均为术中送检的未固定新鲜组织。在送检组织中将选取部分肿物制作冰冻切片（冰冻组织），剩余肿物（冰剩组织）将待冰冻切片完成后一同固定制作组织蜡块，分别制作成冰冻芯片与冰剩芯片。

1.2.1 冰冻切片制作 取新鲜组织平放于冷冻头上，放入OCT包埋剂适量，进行冷冻操作，速冻后切成厚4～5 μm的切片，将其贴在防脱载玻片上。70 ℃预热丙酮固定液，切片置于其内固定2 min后，进行HE染色，由病理科医师对切片进行病理诊断，30 min内发出冰冻报道后，将冰剩组织做成常规石蜡切片，并与冰冻切片结果比较。

1.2.2 组织芯片制作 （1）HE切片于显微镜下明确并标记癌巢;（2）借助HE切片于供体蜡块的相应部位标记为取材部位;（3）将普通病理石蜡融化，进行3次的反复沉淀，加入3%精制蜂蜡，制作成空白蜡块，大小4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，室温冷却;（4）设计10×8点组织列阵，制成模块，从供体蜡块的选定部位用直径0.6 mm的打孔针将组织芯逐个取出，放入预先设计的阵列模块中，于60 ℃保温箱中放置制成的组织芯片模块，轻压模块使其排平。将模块切成薄片，厚3 ?m裱于防脱玻片上，60～70 ℃ 1 h。

1.2.3 检测方法 采用免疫组织化学S-P法检测，标准化试验条件：用全自动免疫组化机器对各芯片进行染色，每次完成一个抗体标记物，即保证标记每一抗体的所有芯片一次性完成试验，所有步骤均由机器自动化完成。所需设备：全自动免疫组化机器（生产厂家：瑞士罗氏公司，型号：Benchmark XT）;试剂：全套罗氏二抗检测试剂ultraView Universal DAB;各种一抗标记物（北京中杉公司）：ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53等;罗氏免疫机所需各种反应试剂：EZprep、LCS、SSC、Reaction Buffer、CC1。

1.3 阳性结果判断标准 Ki-67、P53阳性部位为细胞核，棕黄色，阳性细胞数<10%为阴性（-），阳性细胞数10%～25%为弱阳性（+），阳性细胞数26%～50%为阳性（++），阳性细胞数>50%为强阳性（+++）[2]。cerbB-2阳性细胞为膜着色;细胞数>10%为阳性，着色中等部分不连续为阳性（++），着色弱且不连续为弱阳性（+），着色强且连续为强阳性（+++）[3-4]。ER和PR以核出现棕黄色为阳性，着色细胞数<10%为阳性（+），10%～50%为弱阳性（++），着色细胞数>50%为强阳性（+++）[5]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各种标记物的阳性结果 病例间各标记物阳性表达存在重叠现象，冰剩芯片cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR阳性结果均高于冰冻芯片，差异均有统计学意义（字2=5.738、6.446、5.567、5.584、5.567，P<0.05），见表1。

2.2 术中冰冻切片与术后病理诊断比较 在组织学大小上，术后病理标本共有48例组织学大小≤3 cm，其中38例组织学大小是一致的，符合率为79.17%，组织学大小>3 cm的12例患者，与术后诊断相符者11例，符合率为91.67%。两者比较差异有统计学意义（字2=6.273，P=0.012<0.05），整体符合率为81.67%（49/60）。在肿瘤组织学级别上，术中冰冻与术后石蜡病理总符合率为78.33%（47/60），Ⅰ级符合率为69.23%（9/13），Ⅱ级符合率78.79%（26/33），Ⅲ级符合率为85.71%（12/14）。术中冰冻病理相比于术后石蜡病理组织学级别升高者4例（6.67%），分级下降者9例（15.00%），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。冰剩组织与术后石蜡病理对比，组织学大小≤3 cm符合率93.75%（45/48），组织学大小>3 cm符合率100%，两者比较差异有统计学意义（字2=6.398，P=0.011<0.05），整体符合率为95.00%（57/60）。组织学级别上，整体符合率为91.67%（55/60），与冰冻切片相比差异有统计学意义（P<0.05）。见表2～5。

3 讨论

乳腺癌以浸润性导管癌居多，在我国妇女中发病率较高，病死率亦较高。近年来靶向治疗在临床上的发展较快，且取得较满意的成效。通过标记免疫组化，将为临床靶向药物的选择、病情的预后判断和鉴别诊断提供指导。当前国内外以靶向药物的筛选为主要研究方向，常用的标记物有ER、PR、cerbB-2（her2）、Ki-67、P53等。ER、PR是具有特定功能的蛋白，属于核受体超家族中的甾体激素受体，对乳腺癌的生长、分化有调节作用。研究显示，PR蛋白合成受ER调控，两者均属于表面核受体类，当其结合不同的配体后，受体蛋白转录活性因子发挥作用，两者共同表达时采取辅助内分泌治疗往往能够获益[6]。对ER（+）和/或PR（+）患者，对雌激素合成进行抑制，阻断雌激素与ER合成，降低雌激素水平，可抑制激素依赖性肿瘤的细胞生长，从而发挥治疗作用。因而，了解乳腺癌患者ER、PR的陽性表达情况对指导辅助治疗有重要意义。

cerbB-2是表皮生长因子受体家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是185 kD的跨膜糖蛋白，参与多种信号传导。临床研究显示，乳腺癌CerbB-2受体过表达的患者，采取单克隆抗体类药物Herceptin治疗有效，而阴性患者则治疗无效，表明其是乳腺癌治疗的有效靶点[7]。Ki-67抗原是目前较为肯定的核增殖标志物，其存在于除G0期以外的G1期、S期、G2期及M期。其开始于细胞周期G1期，随着细胞周期的进展其表达逐渐增加，至M期达峰值，之后逐渐下降，在细胞分裂期很快消失。研究表明，Ki-67表达的高低对研究肿瘤的生物学行为、评价细胞增殖状态、判断其危害性有重要意义，且还可作为乳腺癌化疗敏感性指标，相比于肿瘤肿块的缩小，肿瘤细胞增殖率的降低更能反映肿瘤对化疗敏感性[8-10]。P53位于17号染色体短臂上，P53基因突变可能是肿瘤进展恶化的重要因素。研究表明，50%的癌症患者均有P53基因的突变，乳腺癌P53突变率为20%～60%[11-13]。

目前，靶向治疗药物常常费用昂贵，因而对乳腺癌常见的标记物表达情况进行准确检测，对乳腺癌术后规范治疗有重要意义[14-17]。术中快速冰冻切片是判断肿瘤性质的重要方法，能够为临床治疗提供指导，但术中冰冻片仍存在一定的局限性，如冷冻技术影响切片质量等，而影响检测结果[18-20]。本研究中通过前瞻性研究发现，冰冻芯片与冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR阳性结果比较差异均有统计学意义（P<0.05），以冰剩组织的阳性表达更为明显。提示快速冰冻技术会影响乳腺癌标记物的阳性表达，原因分析为在快速冷冻的情况下，因温度在短期内剧烈变化而导致细胞的细胞膜产生跨膜结构破坏，从而影响一些标记物的阳性表达定位，阳性强度减弱，在切片中出现弥散，定位不准确。因而在工作中应尽量避免使用快速冷冻后的样本进行标记物检测，尽量选择冰剩组织进行免疫组织化学染色。同时，本研究中，术中送检冰冻切片检查的组织大小及组织学分级与术后石蜡病理结果符合率仍有待提高，进一步提示术中冰冻切片存在一定局限性，易出现漏诊及误诊的风险，但冰冻技术具有快捷、高效的优点，相比于除石蜡切片诊断以外的其他手段，准确率仍较高。冰剩组织与术后石蜡病理对比，组织学大小≤3 cm符合率93.75%，组织学大小>3 cm符合率100%，两者比较差异有统计学意义（字2=6.398，P=0.011<0.05），整体符合率为95.00%（57/60）。组织学级别上，整体符合率为91.67%（55/60），与冰冻切片相比差异有统计学意义（P<0.05），提示冰剩组织可提供更精准的结果。

综上所述，乳腺癌组织冰冻会影响乳腺癌标记物的阳性表达，建议病理医师选择冰剩组织进行免疫组织化学染色，为患者提供更精准的结果。

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（收稿日期：2019-03-01） （本文编辑：程旭然）