腹主动脉双夹闭法构建大鼠脊髓缺血再灌注损伤的有效性探讨

尉 娜 路 坦

1)新乡医学院第三附属医院神经内二科，河南 新乡 4530032)新乡医学院第一附属医院骨外二科，河南 卫辉 453100

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia/reperfusion injury，SCII)是指解除脊髓受压，血液再通后出现的皮肤麻木、肢体无力等神经损伤症状，甚至发生截瘫或死亡，其发生机制可能是多种因素参与的血液再通后的不可逆性神经缺失[1-4]，其截瘫发生率可能是2.9%～40%[5-6]。SCII的特点是不可预知性、不可逆性及难治性等，因此成为脊髓损伤中较为特殊的一类[7-9]。一旦发生截瘫，SCII患者需要终生康复护理，严重影响患者本身的生活质量，也给家庭、国家带来沉重的经济负担和社会负担。为深入研究SCII的发生机制以及治疗方案，建立合理的SCII的动物模型是十分重要的，但目前构建SCII动物模型方法多种多样[10-12]，探寻理想的合理的动物模型一直是研究人员关注的重点。本研究应用腹主动脉双夹闭法进行大鼠SCII动物模型的构建，并通过动物行为评分、HE染色、髓过氧化物酶检测以及cleaved-caspased-3蛋白检测观察大鼠SCII的有效性。

1 材料与方法

1．1材料

1．1．1 实验动物：SD大鼠，200g左右，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证 SCXK(京)2012-0001)。

1．1．2 实验试剂及仪器：脂氧素A4、cleaved-caspase-3(美国Cayman公司)，白介素1β和肿瘤坏死因子α酶联免疫分析试剂盒(美国R&D公司)，髓过氧化物酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，多功能全波长扫描酶标仪(美国Thermo Multiskan公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，PVDF转印膜、ECL化学发光试剂盒(美国Merck Millipore公司)，RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，多功能全波长扫描酶标仪(美国 Thermo Multiskan公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1．2实验方法

1．2．1 构建大鼠SCII动物模型：实验所用SD大鼠均使用10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，取腹正中切口，逐层切开，暴露腹主动脉及左肾，在左肾动脉开口上端水平及左右髂总动脉分叉水平的腹主动脉处分别使用无创动脉夹闭，30min后放开动脉夹，血流恢复后关腹。时候分笼饲养，肌注青霉素预防感染。空白组大鼠只暴露腹主动脉，不作夹闭处理。

1．2．2 大鼠SCII动物模型的分组及处理：实验所用SD大鼠按随机数字表法分为缺血再灌注组与假实验组，每组16只。缺血再灌注组(SCII组)：制作大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型后30min进行脊髓鞘内注射10 μL生理盐水；空白组(Sham组)：大鼠只暴露腹主动脉，不作夹闭处理。

1．3评估动物模型有效性

1．3．1 运动康复评估：造模后6 h、12 h、24 h、48 h分别评价各组大鼠后肢运动状况，评价方法按照BBB评分[13]。由两个训练有素的人员完成，对实验条件一无所知。实验要在空旷的环境中进行，由观察人员分别观察各只大鼠的活动，包括躯干、后肢以及尾巴，并进行评分(0～21分：0分为没有运动；21分为正常运动)，每只大鼠取两个观察人员的平均值。

1．3．2 检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)：2组大鼠分别在术后6、12、24、48 h后颈椎脱臼法处死，取出腰段脊髓，称取2组脊髓组织(湿质量)100 mg，匀浆后采用邻联二茴香胺法检测MPO活性，测定波长为460 nm(严格按照试剂盒说明书要求操作)。

1．3．3 HE染色：实验大鼠分别于再灌注24h后处死，无菌条件下取出腰段脊髓首先使用4%中性甲醛固定，再应用石蜡包埋后切片，随后行HE染色(切片脱蜡、染色、切片脱水和树脂封片)放入倒置显微镜下观察各组脊髓组织形态。

1．3．4 Western blotting检测脊髓组织的cleaved-caspase-3蛋白表达：实验大鼠分别于再灌注24h后处死，无菌条件下取出腰段脊髓，加入预冷的裂解液，充分研磨后13 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，转移至新的离心管中置于冰上待用。依照标准曲线计算出样品的蛋白浓度，将上样缓冲液放入等量蛋白样品中，97 ℃加热6 min变性，室温冷却离心后上样。采用电转仪将蛋白从分离胶转移至PVDF膜上，转膜完成后，取出PVDF膜，将PVDF膜放入封闭液(TBST/5%脱脂奶粉)中，室温封闭0.5 h。加入一抗(用封闭液稀释)，室温孵育1 h或4 ℃杂交过夜。加入适当比例稀释的二抗，室温孵育1 h，取等体积混合均匀的ECL中的A、B液，滴在PVDF膜上，孵育1min后暗室显影。

2 结果

2．1大鼠运动康复评分SCII组大鼠造模后BBB评分明显低于Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别6h12h24h48hSham组21212121SCII组3.22±0.32#4.38±0.65#4.75±0.82#3.97±0.55#

注：与Sham组各时间亚组相比，#P<0.05

2．2检测髓过氧化物酶活性Sham组各时间点大鼠脊髓的MPO活性较低，均低于SCII组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2．3组织学形态Sham组(图1A)脊髓组织中细胞结构清晰，细胞核完整、居中；SCII组(图1B)脊髓组织中神经元细胞核固缩碎裂，甚至溶解，中性粒细胞等炎性细胞明显亲润。

2．4Westernblotting检测脊髓组织cleaved-caspase-3的表达Sham组大鼠脊髓组织中cleaved-caspase-3蛋白表达明显低于SCII组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨论

为了探索SCII的发病机制及合理的防治方案，常需要更加符合人类功能的动物模型，理想的SCII动物模型需要满足以下几个条件：(1)与人SCII临床表现及发病机制有紧密相关性，可以科学有效地进行模拟人体症状[14-15]；(2)性价比高且简单易行，模型制作可以重复应用；(3)评价动物模型的标准符合国际体系。从模型构建的动物选择而言，恒河猴等灵长类动物的机体功能与人类更加符合，但性价比较低，并且不易获取，因此受到一定局限[16-19]。大鼠繁殖能力强、价格便宜，因此成为各种疾病构建动物模型常选的动物之一，并且大鼠的脊髓供血与人体相似，因而被认为是构建SCII动物模型的常用动物之一[20-21]。大鼠SCII动物模型常需要阻断脊髓供应的血管，目前阻断血流的办法主要集中在动脉夹闭法和气囊阻断法两种[22]。气囊阻断法是较为新颖的阻断血流方法，可以降低动脉的损伤[23]，但阻断血流仍有不完全的可能，因此仍不能替代动脉夹闭法成为构建SCII动物模型的主流方法。而动脉夹闭法是经典的SCII动物模型的构建方法，能够确切阻断脊髓供应血流，并且符合理想SCII动物模型的条件，而且易于重复[24-26]，仍然是制作SCII动物模型的经典方法。

表2 2组大鼠脊髓髓过氧化物酶活性

注：与Sham组相比，#P<0.05

图1 2组大鼠脊髓再灌注24 h后脊髓组织的HE染色(×200)Figure 1 HE staining of spinal cord tissue after spinal cord reperfusion for 24h in 2 groups (×200)

图2 2组大鼠cleaved-caspase-3蛋白含量Figure 2 Cleave-caspase-3 protein content in 2 groups of rats

如何选择夹闭动脉的位置也存在较大争议，动脉阻断位置分别为肾动脉下端部位[27]、肾动脉上方0.5cm[28]或肾动脉和主动脉处等[29]。多种属动物的脊髓血供中有一条较大的根动脉，称为Adamkiewicz动脉，可以供应脊髓1/4～1/2的血液供应，因此在这些动物中阻断该动脉可以得到较佳的缺血损伤，包括人类[30-31]。SCHIEVINK等[32]研究发现，在大鼠体内脊髓供应的根动脉无特殊差别，也就是不存在明确的Adamkiewicz动脉。有研究发现，大鼠体内根动脉之间无明显差别，即没有明确的Adamkiewicz动脉，而且支配腰椎脊髓的根动脉位于肾动脉水平以上的腹主动脉，因此本次研究选择阻断肾动脉水平以上的腹主动脉；另外，为了避免侧支循环的影响，考虑到单纯夹闭腹主动脉造模效果不确切，本次研究选择双夹闭法进行造模，另一处阻断动脉的位置定在左右髂总动脉分叉处的腹主动脉。

本研究显示，通过对2组BBB评分和HE染色发现，当大鼠发生SCII后，BBB评分较空白组明显下降，脊髓组织中神经元发生变性甚至坏死，炎性细胞局部浸润。

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一种血红素蛋白酶，由炎性细胞如中性粒细胞及单核细胞等分泌，因此可以用于评估炎性细胞的浸润程度[33-34]。本研究发现，SCII组大鼠脊髓组织中MPO活性高于Sham组，说明炎症细胞浸润参与了SCII的发病机制。Caspase-3是Caspase家族成员，在真核细胞的生长、分化与凋亡方面起重要的调节作用，被认为是启动细胞凋亡途径的重要组成部分[35-38]。有研究发现[39-40]，当机体受到外界刺激时，可以通过Bcl途径，上调Bax的表达，从而激活下游的Caspase-3，启动细胞凋亡。因此，本研究通过Western blotting检测Caspase-3剪切体水平发现，SCII组Caspase-3剪切体水平较Sham组明显升高，说明Caspase-3参与了大鼠SCII的病理生理过程。

本研究通过改良的双夹闭法阻断腹主动脉血供构建大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，并通过运动康复学评估(BBB评分)、脊髓组织学形态(HE染色)、炎症反应(髓过氧化物酶)和凋亡(cleaved-caspase-3蛋白)证实了动物模型的有效性。操作简便，动脉阻断确切，神经损伤明确，且重复性好，并发症发生率小，是较为合理可靠的大鼠脊髓缺血再灌注损伤的构建方法。