NEMO基因镶嵌突变致男性色素失禁症一例

潘玉雪 杨勇 林志淼

1北京大学第一医院皮肤科 北京市皮肤病分子诊断重点实验室 100034；2中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院遗传室，南京 210042

色素失禁症（incontinentia pigmenti，IP，OMIM 308300）又称为Bloch-Siemens 综合征，是一种少见的X 连锁显性遗传性皮肤病［1］，其发病率约为1/50 000。90%以上的患者为女性，大多数IP 男性患者病情较重，常常于宫内死亡，只有极少数存在核型异常（47-XXY 性染色体异常型，即Klinefelter综合征）、镶嵌突变或轻型点突变等情况的男性患者可以存活［2-4］。该病主要表现为新生儿皮肤在发生红斑、水疱、疣状改变后，最终出现和遗留特征性分布的色素性改变，并且可伴有外胚层、眼、中枢神经系统、骨骼及其他器官异常等症状［5-8］。该病的致病基因为编码核因子κB 关键调节因子（nuclear factor κB essential modulator，NEMO）的 NEMO 基因，其编码蛋白在抑制肿瘤坏死因子α诱导的细胞凋亡中起重要作用［9-10］。我们在临床上收集1个IP家系，对其进行NEMO 基因突变检测，并确定该家系的遗传特点。

资料与方法

一、临床资料

先证者女，9个月，为第1胎第1产，足月顺产，出生后2 周无明显诱因自四肢开始出现棕褐色色素沉着斑，无红斑、水疱，逐渐蔓延至全身。否认父母近亲婚育。皮肤科检查：全身皮肤弥漫分布色素沉着斑，沿Blaschko 线分布，呈泼溅状（图1A ～1C）。其父38 岁，出生后全身出现散在红斑伴痒，渐变黑，局部有增生改变；皮肤科检查示躯干、四肢屈侧及阴囊和阴茎皮肤沿Blaschko 线散在分布色素沉着斑，部分伴有局部增生隆起（图1D ～1E）。牙、眼、骨骼系统和中枢神经系统发育等均正常。先证者父亲色素沉着斑组织病理学检查示，局限性角化过度，表皮增生，伴坏死角质形成细胞，明显界面改变，真皮乳头可见噬黑素细胞（图1F）。先证者及其父亲均诊断为IP。患者母亲及祖父、祖母均无类似病史。

二、方法

1.DNA 提取：本研究经北京大学第一医院医学伦理委员会批准（批件号为2016［1024］），先证者及其家属和健康对照均签署知情同意书。抽取先证者及其父母和200例健康对照外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。取先证者父亲石蜡包埋的皮损组织，用 E.Z.N.A.®FFPE DNA Kit 试剂盒（Omega Bio-Tek公司）提取组织DNA。

2.NEMO 基因4 ～10 号外显子杂合性缺失检测：根据 Steffann 等［11］报道的长链多重 PCR 扩增方法，检测先证者及其父亲外周血DNA 中是否存在NEMO基因4 ～10号外显子杂合性缺失。

图1 色素失禁症患者临床及病理表现 1A ～1C：先证者躯干、四肢沿Blaschko线弥漫分布色素沉着斑，呈泼溅状；1D、1E：先证者父亲躯干和上肢内侧（包括乳头和腋窝）沿Blaschko线散在分布色素沉着斑，局部增生隆起；1F：先证者父亲皮损组织病理检查示局限性角化过度，表皮增生，伴坏死角质形成细胞、明显界面改变，真皮乳头可见无定形物质沉积伴噬黑素细胞（HE×100）

（1）引物合成：参照文献［11］设计引物。正向引物 Int3s：5′-CCACTCAGGGCTTAGAGCGC-3′，Rep3s：5′-CTCTTTTGACAAGAACACCGGA-3′；反向引物L2Rev：5′-TCGGAGACACAGGAACCAGCA-3′。引物 Int3s/L2Rev 只能对具有 NEMO 基因 4 ～10 号外显子杂合性缺失突变的IP 患者扩增出1 045 bp 条带，而引物Rep3s/L2Rev 可以对所有人扩增出733 bp 条带。由北京天一辉远生物科技有限公司合成引物。

（2）PCR 反应及电泳：根据文献［11］推荐条件进行PCR 扩增，扩增结束后，取 5 μl PCR 扩增产物行10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，15 min后在凝胶成像仪下观察结果并拍照。

3.PCR 扩增 NEMO 基因 2 号外显子、3 ～ 10 号外显子长片段和10号外显子：首先，为了解先证者NEMO 基因是否存在致病性点突变的情况，利用PCR 扩增所有血液样本NEMO 基因2 号外显子、3 ～10号外显子长片段，筛查先证者NEMO 基因全部编码外显子（即2 ～10号外显子）及其侧翼序列；然后，利用PCR 扩增先证者父亲石蜡包埋组织中NEMO 基因10 号外显子，验证先证者父亲皮损组织中是否存在与先证者外周血中一致的致病性突变位点。以1 例临床确诊的外周血DNA 中NEMO基因4～10 号外显子缺失的典型色素失禁症女性患者作为阳性对照。

（1）引物设计和合成：根据NEMO基因序列（来源于 Ensembl 网站，网址：http：//www.ensembl.org/index.html），利用 Primer-BLAST 在线版（网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）分别设计2对特异性引物，覆盖NEMO基因2号和10号外显子及其侧翼序列。2 号外显子：正向引物5′-GCCCCAGAACTCATAGGCTT-3′，反 向 引物 5′-TGAAACCAAGAGGGAGGGCA-3′。10 号外显子：正向引物 5′-ACATGAGTGGCCTGTGAGAC-3′，反向引物5′-TGGTTCGAGCAGACAGAAGG-3′。

NEMO 基因下游存在假基因△NEMO，NEMO基因与△NEMO 基因拥有相同的3 号至10 号外显子的DNA 序列。根据NEMO 和△NEMO 基因序列（来源于UCSC网站，网址：http：//genome.ucsc.edu），利用真假基因在2号内含子区域序列的不同，设计1 对仅针对NEMO 基因进行扩增的特异性引物，跨越 NEMO 基因 2 ～ 10 号内含子区域，正向引物 5′-CCACTAACTTGCCTGGTCCAAG-3′，反向引物 5′-CTCCAGGTGGCATCCCAGTT-3′。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

（2）PCR 反应体系及条件：2 号和10 号外显子PCR 扩增反应体系均为25 μl，含基因组DNA 50 ng、dNTP 0.4 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、上下游引物各10 μmol/L、Taq DNA 聚合酶2.5 U。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s（每个循环后退火温度降0.5 ℃），72 ℃延伸45 s，共10 个循环；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。

3 ～ 10号外显子PCR扩增反应体系50 μl，含基因组DNA 50 ng、dNTP 2.5 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、上下游引物各 10 μmol/L、LA Taq DNA 聚合酶2.5 U。反应条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s、61.5 ℃退火30 s、68 ℃延伸15 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

（3）PCR 产物测序分析：所有PCR 产物纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司测序，测序方法为Sanger 双脱氧链终止法。采用Bioedit 软件将测序结果与NEMO基因组序列进行对比。

结 果

一、先证者及其父亲外周血DNA长链多重PCR扩增结果

如图2 所示，先证者及其父亲、健康对照PCR扩增产物中均不存在长度为1 045 bp的条带，表明先证者及其父亲均未发生NEMO 基因4 ～10 号外显子缺失。

二、先证者外周血DNA中NEMO基因筛查结果

以血液DNA为模板进行检测，先证者NEMO基因第10号外显子第1236和1237位核苷酸（从cDNA编码起始位点ATG 算起）之间发生一个核苷酸A插入的杂合突变（c.1236dupA），导致其编码氨基酸发生p.H413fs*7改变，2 ～9号外显子均未检测到致病性突变位点。其患病父亲、未患病母亲及健康人外周血DNA中均未检测到此位点突变（图3）。

图2 多重PCR 扩增产物电泳图 1：100 bp DNA 标准参照物；2：先证者；3：先证者父亲；4：NEMO基因4 ～10号外显子杂合性缺失的色素失禁症患者（阳性对照）；5：健康对照

图3 NEMO 基因突变测序图 3A：先证者外周血中存在c.1236dupA 杂合突变；3B、3C：先证者父母外周血中无c.1236dupA突变；3D：健康对照外周血中无c.1236dupA 突变；3E：先证者父亲皮损组织中存在c.1236dupA镶嵌突变

三、先证者父亲皮损组织DNA中c.1236dupA突变验证结果

先证者父亲皮损组织中存在与先证者外周血相同的c.1236dupA（p.H413fs*7）突变（图3），测序图中突变峰较野生型峰低，提示为体细胞镶嵌突变。

讨 论

IP 的主要临床表现为新生儿期开始出现沿Blaschko 线分布的特征性皮损。典型的IP 患者皮损表现为4期改变［1］。临床上，诊断IP主要根据典型皮损表现和病理学特征，如果患者表现为新生儿期出现典型的红色斑疹和相互重叠的其他3 期皮损，则很容易诊断为IP；但如果患者只表现出色素沉着斑或萎缩性色素减退斑，则会给临床诊断带来困难。

IP 被分为IP1（散发型）和IP2（遗传型）。已报道的IP病例几乎都为IP2。2000年，国际IP联盟确认位于染色体Xq28 上的NEMO 基因为IP2 的致病基因［9］。NEMO 基因，也称为 IKBKG 基因，由 10 个外显子（第一个外显子不编码）组成，编码419个氨基酸，编码蛋白为核因子（NF）-κB 关键调节因子，是一种可激活NF-κB激酶的亚单位，对NF-κB活化至关重要，NF-κB 在免疫调节、炎症反应和细胞凋亡等方面发挥重要作用［10，12-13］。NEMO基因突变导致其编码蛋白NF-κB 关键调节因子活性下降或失去活性，以至于只能部分甚至无法激活NF-κB，角质形成细胞易感于肿瘤坏死因子诱导突变的凋亡，最终触发皮肤炎性反应而出现IP表型［14］。

与IP 相关的NEMO 基因突变的种类多样，包括基因重排、点突变、微重复和缺失等，但其中约80%的突变为NEMO 基因4 ～10 号外显子杂合性缺失［14-15］。本例先证者外周血中NEMO基因第10号外显子发生c.1236dupA 杂合突变，导致氨基酸出现p.H413fs*7改变，移码突变导致蛋白提前产生终止密码子，因此致病意义明确。同时，该突变不存在于ExAC（Exome Aggregation Consortium）和1 000 G数据库，并且不存在于未患病的母亲和健康人外周血DNA中。检索人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD，建库至2018 年4 月），未发现关于NEMO基因c.1236dupA（p.H413fs*7）突变的报道，证实其为新突变。该突变可能改变位于NEMO 蛋白C-末端的锌指区ZF，最终影响核因子κB 激酶复合体和上游激活剂结合及NF-κB 激活［14］。有意思的是，我们在先证者父母的外周血DNA 中均没有检测出此突变，但在父亲皮损组织中检测出c.1236dupA 杂合突变。尽管未能进行父亲精液DNA 检测，但根据父亲皮损组织与其女儿血液突变位点检测结果完全一致，并且父亲有出生后皮肤出现散在红斑的病史，其色素沉着斑皮损组织病理结果基本符合IP的Ⅱ至Ⅲ期皮损特征性病理表现，可以推测NEMO基因c.1236dupA突变可能为引起先证者及其父亲IP 的原因，并且先证者NEMO 基因的c.1236dupA 突变很可能遗传自父亲的生殖细胞镶嵌突变。父亲皮损符合IPⅡ期（疣状增生期），因IP 多数不发生于男性，临床极容易被误诊为表皮痣，这在IP 患者诊断及家系调查中值得引起重视。

Fusco 等［14］发现具有相同NEMO 基因4 ～ 10号外显子杂合性缺失突变的IP 患者表型有很大差异，轻者仅表现为皮肤异常色素沉着，重者还合并多个器官异常症状。Okita 等［16］报道 2 例具有NEMO 基因4 ～10 号外显子杂合性缺失突变的IP患者的母亲，无任何临床症状。X染色体在胚胎时期随机失活（莱昂化现象，lyonization）是导致IP 女性患者表型差异较大的重要原因。本例女性患儿的临床症状较不典型，先证者从未出现过红斑、水疱、丘疹、疣状斑块等皮疹，只在出生2周后无明显诱因自四肢开始出现棕褐色色素沉着斑。通过了解其家族史、检测NEMO 基因，并且对其父亲可疑皮损进行病理学检查及NEMO 基因突变位点验证等，最后确定IP诊断，并且推测先证者基因突变遗传自父亲的镶嵌突变。

总之，对临床上疑诊为IP 的患者，详细了解其家族史，进行皮肤活检和基因检测对早期诊断、遗传咨询及产前诊断有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突