狼疮肾炎患者尿液低氧诱导因子-1α和生长转化因子-β1的变化及意义

李敏，郭毅飞，龚丽，李雪锋

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以多脏器功能损害为主要临床特征的全身性、慢性、炎性结缔组织疾病，常伴有皮肤、肾脏、血液系统、肺和心脏等受累，约70% SLE患者合并狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)，引起较高病死率。临床中若能早期诊断及治疗LN，可能对增加病情缓解几率和改善远期预后有帮助[1]。低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是一种异二聚体转录因子，广泛存在于哺乳动物和人体细胞中，可在T细胞中表达，低氧或炎性因子刺激均可促进其表达增加，它本身也可激活免疫细胞，驱动炎性反应，参与自身免疫性疾病、感染以及肿瘤等疾病的发生[2]。生长转化因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是多功能肽家族的一员，是一种与肾纤维化相关的因子，较多研究证实TGF-β1高表达常参与LN患者肾间质系膜和基质增生，导致病情活动[3]。国内外关于HIF-1α在LN患者中表达情况的研究鲜有报道，现比较LN患者及健康对照人群尿液HIF-1α和TGF-β1水平的差异，分析HIF-1α、TGF-β1与LN疾病活动的关系及其可能的病理生理学机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2014年6月—2016年10月在十堰市太和医院内分泌风湿病科收治的LN患者52例和健康体检者40例作为研究对象，LN患者均经肾组织活检确诊。纳入标准：LN患者均符合美国风湿病学会(ACR)制定的LN分类标准[4]。排除标准：慢性肾脏病(CKD)4期以上及需要透析的LN患者；合并其他原发性或继发性肾脏疾病者；严重心、肝、脑及其他严重遗传疾病者；合并严重感染患者；妊娠及哺乳期患者和合并精神疾病患者。根据文献报道，以狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[4]对患者活动度进行评分作为狼疮活动分组依据：SLEDAI≥8分者33例作为活动期组，SLEDAI<8分者19例作为非活动期组。活动期组男5例，女28例，年龄22～48(33.1±13.7)岁；病理诊断：Ⅲ型10例(30.3%)，Ⅳ型12例(36.3%)，Ⅲ+Ⅴ型5例(15.2%)，Ⅳ+Ⅴ型3例(9.1%)，Ⅴ型3例(9.1%)。非活动期组男3例，女16例，年龄20～47(30.2±14.5)岁；病理诊断：Ⅱ型16例(84.2%)，Ⅰ型3例(15.8%)。2组临床资料见表1。健康对照组均为同期于医院健康体检中心经筛查的健康体检者40例，男7例，女33例，年龄21～47(31.8±15.2)岁；血常规、肝肾功能、hs-CRP、ESR均正常，心电图、心脏彩色超声均正常；并排除结缔组织疾病、高血压、冠心病、肺部疾病、糖尿病、慢性肾炎、合并肿瘤和精神疾病患者。

1.2 肾脏病理学资料 按2003年国际肾脏病学会(ISN)和肾脏病理学会(RPS)制定的LN病理组织学分类标准[5]分为Ⅰ～Ⅵ型：Ⅰ型为正常或微小病变型肾小球肾炎，Ⅱ型为系膜增殖型肾小球肾炎，Ⅲ型为局灶节段增殖型肾小球肾炎，Ⅳ型为弥漫增殖型肾小球肾炎，Ⅴ型为膜性肾病型，Ⅵ型为肾小球硬化型肾小球肾炎。此分类标准，主要用于判断LN总体预后，不能完全反映早期肾脏病理损害的炎性反应程度。在此病理学分类基础上，参照Imran等[6]评分方法，进行狼疮肾组织活动指数评分(AI评分)，主要参考6项指标：肾小球白细胞浸润计数、毛细血管增生、肾间质炎性反应程度、细胞性新月体数、核碎裂纤维素沉积、微血栓形成或白金耳现象和肾小管坏死，各项0～3分，其中新月体数等部分项目0～6分，共计积分0～24分。狼疮性肾炎AI评分是判断其预后的金标准，AI>10分，提示病情重及预后不良，AI与临床表现及严重程度关系密切，AI高者，肾功能受损的可能性较大。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 HIF-1α和TGF-β1检测： 收集研究对象清晨中段尿(女性避开月经期)5 ml，离心提取上清液，采用ELISA双抗夹心法测定HIF-1α和TGF-β1浓度，酶标仪由Benchmark公司生产，试剂盒均由北京普生瑞达生物技术有限公司提供，根据试剂盒说明书进行检测操作。

1.3.2 相关实验室指标检测： LN患者入院次日、健康对照组体检当日晨采集肘静脉血5 ml，离心收取上层血清待测，利用免疫荧光法检测抗双链DNA抗体(dsDNA)，免疫比浊法测定超敏C反应蛋白(hs-CRP)、24 h 尿蛋白定量、血清补体C3、C4浓度，魏氏法测定红细胞沉降率(ESR)。

1.3.3 肺动脉压检测： 利用无创性心脏彩色多普勒检查测定平均肺动脉压力(mPAP)，由不知情且有丰富经验的1名超声科医师检测。

2 结 果

2.1 LN患者临床资料比较 活动期组患者AI评分、SLEDAI评分、mPAH、ds-DNA、补体C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量水平均较非活动组明显增高(P<0.05)，2组患者年龄、补体C4水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 尿液HIF-1α和TGF-β1水平比较 尿液HIF-1α、TGF-β1水平活动期组患者>非活动期组>健康对照组(P<0.05)， 见表2。

表2 3组尿液HIF-1α和TGF-β1水平比较

2.3 相关性分析

2.3.1 尿液HIF-1α及TGF-β1与临床指标的单因素相关性分析： LN患者尿液HIF-1α与TGF-β1水平呈正相关性(r=0.534，P=0.021)。 HIF-1α与SLEDAI评分、mPAH、24 h尿蛋白量、ESR、hs-CRP、AI评分呈正相关(P均<0.05)；TGF-β1与SLEDAI评分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA呈正相关性(P均<0.05)，与补体C3水平呈负相关性(P<0.05)，见表3。

表3 LN患者尿液HIF-1α、TGF-β1水平与一般临床指标的相关性

2.3.2 LN患者尿液HIF-1α及TGF-β1水平与肾脏病理学的关系: LN患者尿液HIF-1α水平与肾脏病理AI评分呈正相关性(r=0.356，P=0.012)，TGF-β1与肾脏病理AI评分无相关性(r=0.042，P=0.213)。Kruskal-Wallis分析表明，尿液HIF-1α和TGF-β1水平在不同LN肾脏病理分型患者中差异无统计学意义。

2.3.3 多元逐步回归分析: 以LN活动期患者AI评分作为模型因变量，以活动组与非活动组存在差异的指标HIF-1α、TGF-β1、AI评分、mPAH、ds-DNA、ESR、补体C3、hs-CRP和24 h尿蛋白定量为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果表明，尿液HIF-1α浓度、ds-DNA浓度和24 h尿蛋白定量是影响LN患者预后的独立危险因素，见表4。

3 讨 论

LN是SLE最严重的并发症之一，回顾性临床研究提示根据肾脏病理学检查，几乎所有的SLE患者在病程的不同阶段均表现出不同程度的肾脏损害[7]。传统观点认为机体自身反应性淋巴细胞的激活和非自身抗原间平衡关系被打破，体液免疫亢进是导致LN发生的主要原因，但近年研究发现SLE的严重程度和病变范围与致炎和抗炎细胞因子之间的平衡关系也较为密切[8]。24 h尿蛋白定量和尿残渣分析常被作为评价LN肾损害程度粗略的标志物，但该指标缺乏特异性，容易受到发热、尿路感染等其他SLE并发因素的影响，临床中尚缺乏能准确反映不同病理类型LN损害程度、监测病情活动和判断预后的检测指标。

表1 LN活动期组与非活动期组临床资料比较

表4 影响LN患者预后的多因素Logistic回归分析

HIF-1α是机体在低氧、炎性反应等特殊环境下产生的一种关于适应性细胞氧自稳态调控因子，基础研究表明HIF-1α在许多肾脏疾病中具有“双刃剑”作用，一方面可加快细胞代谢，改善血流动力学，增强肾脏对缺氧的适应性，而起到保护肾脏的作用[9]。另一方面，HIF-1α及其相关性低氧状态会诱发调节血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、结缔组织生长因子(cTGF)和转化生长因子(TGF)等的合成及分泌，导致肾小管上皮细胞的吸收和排泌障碍，诱导肾小球内皮细胞凋亡，促进肾间质纤维化[10]。Feng等[11]研究表明，HIF-1α的基因功能对 SLE 患者体内辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)免疫平衡产生影响，血清HIF-1α水平的增高可能导致免疫耐受破坏，并对体内炎性细胞因子白介素-17(IL-17)的表达量产生影响，与SLE疾病活动密切关联。目前国内尚无关于HIF-1α在LN患者中作用及作用机制的相关报道，本研究表明，LN患者尿液HIF-1α水平较正常人明显增高，且LN活动期组患者尿液HIF-1α水平高于非活动期组，LN患者HIF-1α水平与mPAH、SLEDAI评分等多项疾病活动标志物呈正相关性，提示HIF-1α在反映SLE整体病情活跃中的预测作用。Logistic回归分析结果则进一步确认了尿液HIF-1α浓度是影响LN患者疾病活动的独立危险因素。

Ogura等[12]进行的动物研究表明HIF-1α对缺血导致肾损害鼠模型病理影响以肾间质损害为主，表现为肾小管扩张、间质水肿，炎性细胞浸润及出现纤维化。其他研究发现，LN患者和MRL/lpr狼疮肾炎模型小鼠肾小球和肾间质均有HIF-1α表达量的增加，并且病理检查可见大量间充质细胞(MCs)浸润，而经治疗或HIF-1α阻断剂(dimethyloxaloylglycine，DMOG)处理后，肾脏炎性反应活动可明显减轻[13]。本研究表明LN患者HIF-1α水平与肾脏病理AI评分呈正相关性，且在以肾小球细胞增殖性改变和纤维素样坏死为主要表现的Ⅲ型、Ⅵ型LN患者中有增高趋势，与动物实验的病理表现存在一定差异性。推测产生差异的原因可能为HIF-1α在不同哺乳动物肾脏的表达存在差异，对免疫功能的影响作用也不尽相同。此外，本研究LN患者肾功能异常者较少，肾脏损害程度并不十分严重，此种情况下肾小球滤出的HIF-1α可在近端肾小管部分被重吸收，不能完全反映出不同病理类型中其表达量的差异性。肺动脉高压是反映SLE活动性及判断预后的重要依据，肺动脉高压与LN的发生有密切联系[7]。本结果表明LN患者HIF-1α与mPAH呈正相关性。动物研究表明HIF-1α可通过上调VEGF和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，促进肺动脉内膜血管内皮细胞增殖，进而促进血管生成，加速缺氧性肺动脉高压[14]。故而推测SLE患者体内HIF-1α的变化可能促进了SLE肺动脉高压的形成，尚需更多的基础与临床研究证实。

TGF-β1为广泛存在于人类和其他哺乳动物多功能肽超家族中的一员，人体内主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的表达，它们具有相似的生物学特性。TGF-β1是一种与纤维化关系密切的细胞因子，通常由巨噬细胞、成纤维细胞、间质细胞等多种细胞分泌，在组织纤维化中具有重要作用[15]。基础研究表明肾小管液中高浓度TGF-β1能诱导单核细胞趋化因子(MCP-1)的表达，增加单核—巨噬细胞在肾组织中浸润，并可通过促进细胞外胶原沉积，增加肾小管上皮细胞增殖与分化等多种生物学效应，导致肾小球炎性反应和肾脏间质纤维化[16]。石鑫岳等[17]通过对不同病理类型的LN患者尿液标志物进行检测，结果发现在以系膜和基质增生为主要病理特点的系膜增生肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎和新月体性肾小球肾炎的患者中尿液TGF-β1水平增加较为明显。本项研究中，LN活动期患者尿液TGF-β1表达量明显增加，与Susianti等[18]报道基本一致。LN患者尿液TGF-β1水平与AI评分、SLEDAI评分、24 h尿蛋白定量及ds-DNA等常见的SLE疾病活动度的临床指标呈正相关性，而与补体C3水平呈负相关性，推测TGF-β1可能通过某些生物学作用，导致补体系统功能亢进，消耗大量补体C3，造成低补体血症，诱发SLE疾病活动。此外，本研究发现LN患者尿液HIF-1α与TGF-β1浓度呈正相关性，并且HIF-1α与患者疾病活动呈显著相关性，提示HIF-1α可能作为TGF-β1的一种调控因子，通过激活某些潜在信号通路介导TGF-β1的过度表达，加重SLE肾损害。但是，本研究LN患者HIF-1α与TGF-β1浓度并未在不同LN肾脏病理学AI评分及肾脏病理类型患者中表现出完全一致性变化，提示二者在LN中的作用非常复杂，而患者肾脏病理AI评分同样也会受到SLE 长期病程中多种混杂因素的影响，该研究并不一定能够完全反映LN部分患者潜在的疾病活动状态。

总之，LN的发生是一个原因复杂、多因素共同参与的结果，本研究提示HIF-1α和TGF-β1水平的增加可能参与LN的发病，并且与疾病活动度关系密切，后续需通过前瞻性、更大样本量的临床研究提供更具说服力的判断，通过深入了解二者在LN中的作用机制，尿液HIF-1α和TGF-β1的测定有可能成为LN病情检测的重要指标，对LN的早期治疗及寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。

利益冲突：无

作者贡献声明

李敏：设计研究方案、实施研究过程及论文撰写；郭毅飞、龚丽：资料收集；李雪锋：论文审核