HIV感染者外周血PD-1、TIGIT基因表达水平与T细胞分化、凋亡分子分泌的相关性

欧仕颖，余长芳，余海霞，泽汪格玛，杨建蓉

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染能够引起获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，主要表现为CD4+T细胞功能缺陷[1-2]，严重威胁人类健康，但具体发病机制未明。免疫细胞表面的免疫调控受体在免疫细胞分化、增殖、凋亡等生物学行为的调节中发挥至关重要的作用，其中程序性死亡分子1(programmed death 1，PD-1)和 T 细胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸样抑制基序(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是起到负性调控作用的2种免疫调控受体，已经被证实在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T细胞中呈高表达趋势且与CD4+T细胞的数目呈负相关[3-4]，由此提示PD-1及TIGIT的高表达与HIV感染后CD4+T细胞功能的缺陷有关。CD4+T细胞包含了多种辅助性T细胞(T helper，Th)及调节性T细胞(regulatory T，Treg)亚群，CD4+T细胞总数发生变化的过程中，不同亚群也会出现不同的改变。为了进一步明确PD-1、TIGIT 2种免疫调控受体在HIV感染进程中所起到的作用，现分析HIV感染者外周血PD-1、TIGIT基因表达水平与T细胞分化、凋亡分子分泌的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年6月—2018年8月四川省甘孜藏族自治州人民医院传染病科诊断为HIV感染的患者80例作为HIV组，均符合中华医学会感染病学分会艾滋病学组制定的艾滋病诊断标准[5]，经免疫印迹法确诊为HIV阳性，均为初次确诊、未接受过抗病毒治疗。HIV组男49例，女31例，年龄22～54(31.93±5.83)岁；病程9～34(17.38±3.23)月；合并糖尿病29例，高血压17例，高脂血症14例。另取同期在医院体检的健康者60例作为健康对照组，男34例，女26例，年龄21～55(32.15±6.24)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，全部受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标与方法 2组受试人员均清晨空腹采集肘静脉血8～10 ml，-80℃置入冰箱备用。

1.2.1 PD-L1、TIGIT mRNA表达检测： 取上述血液2～3 ml抽提RNA并反转录合成cDNA，按照cDNA 1 μl、UltraSYBR Mixture试剂10 μl、引物混合液0.8 μl、去离子水8.2 μl配置反应体系，进行荧光定量PCR反应后计算PD-L1、TIGIT的mRNA表达。试剂盒及UltraSYBR Mixture试剂购自北京康为世纪公司。

1.2.2 CD4+T细胞亚群检测：取上述血液3～4 ml以EDTA抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单核细胞(PBMC)后用RPMI1640调节细胞密度至2×106/ml，每个反应管内分装细胞悬液100 μl。避光孵育PC5标记的CD4抗体、PE标记的IFN-γ抗体后以流式细胞仪(NovoCyte 1040，艾森生物公司产品)测定Th1细胞数目。避光孵育PC5标记的CD4抗体、PE标记的IL-4抗体后在流式细胞仪上测定Th2细胞数目。避光孵育PC5标记的CD4抗体、PE标记的IL-9抗体后在流式细胞仪上测定Th9细胞数目。避光孵育FITC标记的CD4抗体、PE标记的IL-17抗体后在流式细胞仪上测定Th17细胞的数目。避光孵育FITC标记的CD4抗体、PE标记的CD25抗体、PE-cy5标记的Foxp3抗体后在流式细胞仪上测定Treg细胞的数目。

1.2.3 血清凋亡分子检测： 取上述血液2 ml后离心分离血清，采用酶联免疫吸附法测定B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、自杀相关蛋白因子(Fas)、Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TRAIL的含量，试剂盒购自上海西唐生物公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，2组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组PD-L1、TIGIT mRNA表达水平比较 与健康对照组比较，HIV组外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表达水平均明显升高(P<0.01)，见表1。

表1 2组PD-L1、TIGIT mRNA表达水平比较

2.2 2组外周血CD4+T细胞亚群数目比较 与健康对照组比较，HIV组外周血Th1、Th17细胞数目明显降低，Th2、Th9、Treg细胞数目明显升高(P均<0.01)，见表2。

2.3 2组血清凋亡分子含量比较 与健康对照组比较，HIV组血清Bcl-2含量明显降低，Fas、FasL、TNF-α、TRAIL含量明显升高(P均<0.01)，见表3。

2.4 相关性分析 HIV组外周血PD-L1及TIGIT的mRNA表达水平与外周血Th1、Th17细胞数目以及血清Bcl-2含量呈负相关(r=-0.623、-0.591、-0.657、-0.452、-0.524、-0.612，P均<0.05)，与外周血Th2、Th9、Treg细胞的数目以及血清FasL、Fas、TNF-α、TRAIL的含量呈正相关(r=0.475、0.563、0.608、0.498、0.632、0.574、0.538、0.475、0.551、0.561、0.494、0.601、0.526、0.583，P均<0.05)。

3 讨 论

HIV感染后主要通过杀伤CD4+T细胞来引起免疫缺陷， 但其机制仍未完全明确。PD-1和TIGIT是在免疫细胞表面广泛表达的2种免疫调控受体，主要对免疫细胞的分化成熟、增殖起到负性调控作用。PD-1的配体PD-L1是B7家族中的T细胞共抑制分子，PD-L1与PD-1结合后一方面能够通过细胞内的SHP-2的磷酸化来引起T细胞表面受体通路中的多种反应发生去磷酸化，进而抑制T细胞的分化成熟；另一方面能够直接启动细胞内的凋亡信号通路，诱导T细胞发生凋亡[6-7]。TIGIT在与免疫酪氨酸样抑制基序结合后能够产生抑制性信号，进而抑制T细胞的分化成熟[8]。刘婷婷等[9]研究认为，PD-1和TIGIT 2种分子在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T细胞中的表达明显增多且与CD4+T细胞数目、HIV病毒载量有关。本研究结果发现，HIV组外周血中PD-L1、TIGIT的mRNA表达水平均明显高于健康对照组。这一结果表明HIV感染患者外周血中PD-L1及TIGIT的高表达不是仅仅存在于CD3+CD4-T细胞表面，而是存在于整体水平，结合2种分子的生物学特性以及HIV病程中CD4+T细胞功能的衰竭也能够进一步提示，PD-L1及TIGIT的高表达能够影响HIV病程中CD4+T细胞的分化及其相应亚群的功能。

CD4+T细胞包含了多种亚群，在免疫应答过程中发挥了不同的作用[10]。Th1和Th2细胞是最早发现的CD4+T细胞亚群，Th1主要分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子，能够促进细胞免疫应答且能发挥抗病毒、抗肿瘤作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5等细胞因子，能够促进体液免疫、变态反应但容易造成病毒、肿瘤发生免疫逃逸[11-12]。Th17和Treg是新发现的一对CD4+T细胞亚群，前者主要分泌IL-17并且具有较强的促炎及刺激T细胞活化的作用，能够增强机体的抗病毒能力；后者具有免疫抑制活性，通过分泌TGF-β1等抑制性细胞因子以及细胞间接触抑制的方式来对免疫应答起到负性调控作用[13-14]；Th9是新发现的功能与Th2相近的CD4+T细胞亚群，其分泌的IL-9能够通过与受体IL-9R结合来抑制免疫功能[15]。本研究对HIV感染患者外周血中CD4+T细胞亚群的分析发现，HIV组外周血中Th1、Th17细胞的数目明显低于健康对照组，Th2、Th9、Treg细胞的数目明显高于健康对照组。这一结果表明虽然HIV感染能够直接攻击和杀伤CD4+T细胞，使CD4+T细胞的总数降低，但不同CD4+T细胞亚群的变化仍存在差异，具有细胞免疫应答活性的Th1及Th17亚群分化受阻，具有免疫抑制活性的Th2、Th9、Treg亚群分化反而增强，进而有利于HIV脱离免疫应答的监视、不断繁殖并加重其对免疫功能的破坏。进一步分析外周血PD-L1及TIGIT表达与HIV感染患者CD4+T细胞亚群的关系可知，PD-L1、TIGIT的表达水平与Th1、Th17的数量呈负相关，与Th2、Th9、Treg的数量呈正相关。这一相关性的结果提示HIV感染患者外周血中高表达的PD-L1、TIGIT能够影响CD4+T细胞亚群的分化，阻碍Th1、Th17的分化，促进Th2、Th9、Treg的分化，进而使HIV感染患者体内的免疫应答发生缺陷。

免疫细胞表面的PD-1和TIGIT一方面能够通过阻碍细胞的分化成熟来影响免疫功能，另一方面也能直接刺激细胞凋亡程序活化、诱导细胞发生凋亡。细胞内介导凋亡的程序包括线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径。Bcl-2是在线粒体凋亡途径中发挥抗凋亡作用的分子，能够减少线粒体内细胞色素C的释放并阻碍由细胞色素C介导的细胞凋亡[16]；FasL/Fas、TRAIL/TNF-α是在死亡受体凋亡途径中发挥促凋亡作用的分子，通过配体—受体的方式结合后能够在细胞内招募Caspase分子并促进其发生级联激活，最终引起细胞发生凋亡[17]。本研究对HIV感染患者血清中凋亡分子含量的分析发现，HIV组血清中Bcl-2含量明显低于健康对照组，FasL、Fas、TNF-α、TRAIL含量明显高于健康对照组。这一结果表明HIV感染能够造成患者体内的线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径发生过度激活，血清中抗凋亡分子的含量减少、促凋亡分子的含量增多。进一步分析外周血PD-L1及TIGIT表达与HIV感染患者体内凋亡分子分泌的关系可知，PD-L1、TIGIT表达水平与Bcl-2含量呈负相关，与FasL、Fas、TNF-α、TRAIL含量呈正相关。这一相关性的结果提示HIV感染患者外周血中高表达的PD-L1、TIGIT不仅能够影响CD4+T细胞的分化过程，还能通过激活细胞凋亡来造成CD4+T细胞的耗竭。

表2 2组CD4+T细胞亚群数目比较

表3 2组间血清凋亡分子含量比较

综上所述，HIV感染者外周血中PD-1、TIGIT表达明显增多；高表达的PD-1、TIGIT一方面影响 CD4+T细胞亚群的分化，表现为阻碍Th1、Th17的分化，促进Th2、Th9、Treg的分化；另一方面影响凋亡分子的分泌，促进细胞发生线粒体途径和死亡受体途径的凋亡。

利益冲突：无

作者贡献声明

欧仕颖：负责研究设计、开展及论文撰写;余长芳、杨建蓉：负责数据收集；余海霞：负责论文审核及修改；泽汪格玛：负责统计分析