磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶信号传导通路在慢性阻塞性肺疾病发展“快”“慢”表型中的作用差异研究

马红霞，王兵

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一种可防可治的疾病，主要临床特征为持续气流受限，与肺部、气道对气体或有害微粒的慢性异常反应有关［1］。COPD患者肺功能呈进行性下降，且其下降速度表现出两种极端表型，一种是发展“快”，即发病短时间内病情迅速进展，全身状况和肺功能迅速恶化；另外一种是发展“慢”，即发病很长时间内病情、全身状况及肺功能相对稳定［2］。既往研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosito1-3-kinase，PI3K）/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号传导通路通过调控炎性递质释放、炎性细胞活化及气道重构等在慢性气道炎性疾病中发挥重要作用［3］。本研究旨在探讨PI3K/Akt信号传导通路在COPD发展“快”“慢”表型中的作用差异，以期对COPD防治工作提供一定参考价值。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

1.1.1 纳入标准 （1）年龄30～80岁；（2）未伴有严重α1-抗胰蛋白酶缺乏者；（3）近1个月内未服用激素及其他免疫抑制剂、未接受过脱敏治疗者。

1.1.2 排除标准 （1）行人工机械通气治疗者；（2）伴有重度呼吸衰竭者〔动脉血氧分压（PaO2）＜40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），伴或不伴有动脉血二氧化碳分压（PaCO2）＞90 mm Hg〕；（3）合并活动性结核、肺癌、肺纤维化等其他类型严重慢性呼吸系统疾病者；（4）合并心力衰竭、糖尿病、高血压等可能影响试验结果的慢性疾病者；（5）合并肺性脑病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、任何部位迁延不愈或急慢性感染性疾病者；（6）无法准确提供病史及有精神疾病者。

1.2 一般资料 选取2017—2018年新疆医科大学附属中医医院呼吸科门诊或住院的COPD患者116例，均符合2015年修订版慢性阻塞性肺疾病全球防治创议（GOLD）中COPD的诊断标准［4］，其中发展“快”表型者26例（A组）、发展“慢”表型者90例（B组）。A组患者中男14例，女12例；年龄38～68岁，平均年龄（52.1±9.3）岁。B组患者中男46例，女44例；年龄37～69岁，平均年龄（52.8±9.4）岁。另选取同期新疆医科大学附属中医医院体检中心体检健康者90例作为对照组，其中男47例，女43例；年龄39～68岁，平均年龄（53.0±9.1）岁。三组患者性别（χ2=0.07）、年龄（F=0.10）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经新疆医科大学附属中医医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者对本研究知情并签署知情同意书。

1.3 诊断标准 （1）COPD发展“快”表型诊断标准：①体质指数＜21 kg/m2，②慢性阻塞性肺疾病评估测试（CAT）评分＞20分，③改良英国医学研究学会呼吸困难指数（mMRC）≥3级，④年住院次数≥2次，⑤年急性加重次数≥3次，⑥病程≤5年但肺功能分级≥Ⅲ级；满足⑥及①～⑤中任意两个条件者为发展“快”表型。（2）COPD发展“慢”表型诊断标准：①体质指数≥21 kg/m2，②CAT评分≤20分，③mMRC≤2级，④年住院次数≤1次，⑤年急性加重次数≤2次，⑥病程≥15年但肺功能分级≤Ⅱ级；满足⑥及①～⑤中任意两个条件者为发展“慢”表型［5］。

1.4 观察指标

1.4.1 PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、Akt及磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（p-Akt） mRNA相对表达量 自NCBI中GEO数据库中获取PI3K和Akt基因信息，设计实时荧光定量聚合酶链反应（qRTPCR）引物，以cDNA为模板，采用qRT-PCR分析三组受试者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相对表达量。

1.4.2 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量采用Western blot法检测PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量［6］，具体方法如下：采集三组受试者外周静脉血2 ml，与15 μl PMSF和200 μl细胞裂解液进行匀浆，之后于冰上裂解30 min，4 ℃环境下12 000 r/min离心5 min（离心半径60 cm），去上清液；将1/4倍量5×SDS上样缓冲液与蛋白质样品混合均匀，热水煮沸7 min，用10%SDS-PAGE 115 V电泳，200 mA恒流2 h，湿转至硝酸纤维膜上，再以5%脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭3 h，加一抗（即鼠抗人PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt，以1:500稀释）。TBST洗膜3次，10 min/次，然后与结合有辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（1:4 000稀释）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，与化学发光试剂（ECL）反应，X线胶片曝光显影。PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量测定采用灰度值扫描，并将β-actin作为内参，灰度值之比为蛋白相对表达量。

1.4.3 炎性细胞因子 抽取三组受试者外周静脉血3 ml，离心，分离血浆并置于-80 ℃环境下保存备用。采用CBA流式液相多重蛋白定量技术检测血浆白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。

1.4.4 肺功能指标 采用德国耶格MasterScreen PFT System肺功能仪检测三组受试者第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%pred）、用力肺活量占预计值百分比（FVC%pred）及第1秒用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV1/FVC）。记录三组受试者mMRC评分、CAT评分，mMRC评分越高提示患者呼吸困难越严重，CAT评分越高提示患者肺功能越差［7］。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；计数资料分析采用χ2检验。以（双侧）P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相对表达量三组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组和B组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相对表达量高于对照组，B组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相对表达量低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量 三组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组和B组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量高于对照组，B组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 三组患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相对表达量比较（x±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in the three groups

2.3 炎性细胞因子 三组患者血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组和B组患者血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平高于对照组，B组患者血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 三组患者炎性细胞因子比较（x±s，ng/L）Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in the three groups

2.4 肺功能指标 三组患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC、mMRC评分、CAT评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组和B组患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC低于对照组，mMRC评分和CAT评分高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC高于A组，mMRC评分和CAT评分低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表 4）。

表4 三组患者肺功能指标比较（x±s）Table 4 Comparison of pulmonary function indexes in the three groups

3 讨论

COPD是一种常见的呼吸系统疾病，也是全球范围内发病率和病死率升高的重要原因之一［8］。临床实践中发现，COPD虽然呈进行性发展，但病情发展速度不同，主要表现为发展“快”“慢”两种表型，而研究COPD发展“快”“慢”表型的发生机制对COPD防治工作具有重要参考价值。

PI3K/Akt信号传导通路是细胞内的经典信号通路，其可参与细胞炎症、细胞凋亡及自噬等环节［9］。PI3K是一个异源性二聚体，作为联系细胞应答效应和外信号的中介分子，属于催化磷酸肌醇3-OH端磷酸化的一类蛋白质家族，具有重要生物学特征［10-11］。Akt被称为蛋白激酶B，是PI3K信号通路中的关键信号传导分子，对细胞凋亡、增殖等具有重要调控作用［12］。近年来，PI3K/Akt信号传导通路在COPD炎性反应机制及抗炎治疗中的作用受到临床关注［13］。本研究结果显示，A组和B组患者PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt mRNA及蛋白相对表达量高于对照组，B组患者PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt mRNA及蛋白相对表达量低于A组，提示COPD发展“快”表型与PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt基因及蛋白表达上调有关。

既往研究表明，COPD患者气道内存在炎性细胞活化及大量化学因子、细胞因子及炎性递质，它们参与调节气道炎性反应，其中TNF-α是COPD的主要细胞因子之一［14］。既往研究表明，TNF-α过度表达导致肺组织损伤加重及炎性反应慢性化，在COPD患者肺组织损伤过程中起重要作用［15］。近年来随着临床对炎性因子研究深入发现，IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子与COPD发生、发展密切相关［16］。本研究结果显示，A组和B组患者血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平高于对照组，B组患者血浆IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平低于A组，提示与COPD发展“慢”表型相比，COPD发展“快”表型患者气道炎性反应更严重。本研究结果还显示，A组和B组患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC低于对照组，mMRC评分和CAT评分高于对照组；B组患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC高于A组，mMRC评分和CAT评分低于A组，提示与COPD发展“慢”表型相比，COPD发展“快”表型患者肺功能更差。分析COPD发展“快”表型患者气道炎性反应更严重、肺功能更差的机制可能与PI3K/Akt信号传导通路有关：PI3K/Akt信号传导通路能调控炎性递质释放、炎性细胞活化，其磷酸化使炎性递质过度释放，进而导致气道重塑及气管收缩，同时其产生的基质金属蛋白酶（MMPs）、弹性蛋白酶等可破坏肺实质，导致肺功能迅速降低［17-21］。

综上所述，COPD发展“快”表型与PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt基因及蛋白表达上调有关；与COPD发展“慢”表型相比，COPD发展“快”表型患者肺功能更差，可能与PI3K/Akt信号传导通路调控炎性细胞因子有关，但具体作用机制仍有待进一步研究。此外，COPD和哮喘均是气流受限疾病且存在明显易感交互作用，故本研究未排除哮喘患者，可能在一定程度上影响研究结果。

作者贡献：马红霞进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，进行结果分析与解释，负责撰写论文，负责文章的质量控制及审校；马红霞、王兵进行数据收集、整理、分析,对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。