胃癌合并幽门螺杆菌感染患者CYP2C19基因型与其预后的关系分析

张海梅，张嘉刚，杨世荣，戚利坤

胃癌是我国最常见的外科恶性肿瘤，发病率较高，居各类肿瘤之首。现研究发现该病的发生有很大的遗传相关性，临床主要表现为上消化道出血、穿孔等症状[1]。目前的研究表明，与恶性肿瘤相关的CYP2C19基因是由人细胞色素P450超家族基因编码的同工酶的亚型[2]。该酶主要存在于肝细胞微粒体中，与质子泵抑制剂代谢密切相关，因此是胃癌的发生中重要的环节[3]。CYP2C19成为一个重要的致病因素，首先可激活前致癌物，其次又可提高致癌物基因决定的易感性，但目前具体的机制尚不明确。进一步有临床数据显示，CYP2C19基因多态性与多种恶性肿瘤相关，如前列腺癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等[4-5]，推测CYP2C19基因与胃癌发生关系密切。文献中关于胃癌合并幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染患者CYP2C19基因型与其预后的关系的研究尚未见报道，因此本研究中选取胃癌合并H.pylori感染并行远端胃切除术患者50例为观察组，选择50例未感染H.pylori的远端胃切除术胃癌患者作为对照组，讨论胃癌合并H.pylori感染患者CYP2C19基因型与其预后的关系，为明确胃癌的诊断及预后提供依据。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取2014年1月至2016年10月青海省第五人民医院收治的胃癌合并H.pylori感染并且进行远端胃切除手术的患者50例为对照组，同时选取胃癌未合并H.pylori感染并且进行远端胃切除手术的患者50例为观察组。本项临床研究由青海省第五人民医院伦理委员会批准，所有受试者均了解试验项目并签署了知情同意书。纳入标准：①根据临床症状、病史、介入检测、影像学检测或病理学检查、实验室检查等证实符合胃癌诊断标准，且观察组患者证实有H.pylori感染，并行远端胃切除术治疗；②无其他器质性疾病；③无血液系统等其他系统疾病。排除标准：①有肺实质病变如支气管哮喘、支气管扩张、肺结核等疾病和间质性肺疾病等肺部疾病；②有除胃癌外的其他恶性肿瘤及胃癌转移性肿瘤：③合并有血液、泌尿系统等严重疾病者；④术后1年无法配合研究或中途退出研究的患者。观察组男性28例，女性22例，年龄(71±2.7)岁；对照组男性30例，女性20例，年龄(70±3.2)岁，纳入研究对象的性别和年龄无统计学差异。由表1可知，两组研究对象的病程分期无统计学差异(P>0.05)，表明两组具有可比性。

表1 两组研究对象的一般资料

1.2 CYP2C19基因型检测

1.2.1 清晨空腹抽取患者外周血2 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存。采用TIANamp Blood DNA Kit(天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。

1.2.2 PCR引物 PCR引物设计 CYP2C19基因外显子4突变型(*3)和CYP2C19基因外显子5突变型(*2)的上下游引物设计见表2。

表2 CYP2C19基因外显子突变型的上下游引物设计

1.2.3 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测CYP2C19基因型步骤如下：①PCR扩增：在PCR板中．每孔加入4 μL PCR mix和1 μL DNA，薄膜封闭，混匀，低速离心机(4 000 r/min)离心2 min后上机(PCR仪器)进行循环，循环条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，45个循环，然后72 ℃延伸，4 ℃保存。②使用限制性内切酶对产物进行酶切，过夜，3%琼脂糖凝胶电泳，结果分析。

1.2.4 质谱检测将准备好的样本加入到样本板中，再放入MassArray点样仪。接着将点好样本的芯片放入MassArray质谱仪，进行质谱检测，最后在数据服务器上通过Typer 4.0软件进行分析。

1.3 DAGCS32得分

在术后一年对患者进行电话随访，根据文献采用胃癌切除术后评分系统(dysfunction after gastric cancer surgery 32, DAGCS32)[6]对患者反馈的与术后功能障碍相关的32项信息进行1(无)到5(非常严重)评分，分数越高表示功能障碍越严重。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 基因分型

基因型检测结果表明，CYP2C19*2基因和CYP2C19*3基因均分为3型，其中2位点基因均为GG的为纯合子快代谢型，GG+GA、GG+AA和GA+GA均为杂合子快代谢型，GA+AA和AA+AA为慢代谢型，结果见表3和图1。

表3 CYP2C19基因分型结果

图1CYP2C19*2基因分型 图a是CYP2C19*2 的 AA 基因型典型质谱图;图b是CYP2C19*2 的 GG 基因型典型质谱图;图c是CYP2C19*2 的 GA 基因型典型质谱图;图d是CYP2C19*3 的 GG 基因型典型质谱图;图e是CYP2C19*3 的 GA 基因型典型质谱图;图f CYP2C19 基因型 PCR-RFLP 电泳图, M：50 bp Marker，1：PCR 产物，2：*1/*1型，3：*1/*2型，4：*2/*2型,5：*1/*3型，6：*3/*3型

2.2 基因型分布

两组CYP2C19基因的纯合子快代谢型、杂合子快代谢型和慢代谢型发生率见表4。纯合子代谢型在观察组的发生率(32%)和对照组的发生率(42%)进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)；杂合子快代谢型在观察组的发生率(40%)和对照组的发生率(46%)进行比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)；而慢代谢型在观察组的发生率(28%)和对照组的发生率(12%)比较，观察组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 两组CYP2C19代谢类型构成比较[n(%)]

2.3 远端切除术

一年后,两组中纯合子快代谢型、杂合子快代谢与慢代谢型患者DAGCS32得分相比差异均具有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 两组不同CYP2C19代谢类型患者DAGCS32得分分)

3 讨论

在我国，胃癌是最常见的外科恶性肿瘤之一，发病率高，治愈性差，预后差，病因复杂，迄今尚未完全阐明[7-8]。研究资料表明,胃癌的发生与多种因素相关，包括长期吸烟或酗酒，饮食习惯不良，长期与硫酸尘雾接触等，是多种因素综合作用的结果[9-10]。同时，研究表明，H.pylori是胃癌发生重要因素之一[11-14]。H.pylori具有较强的感染力，2014年世界卫生组织国际癌症研究所(international agency for research on cancer, IARC)发布的《根除幽门螺杆菌感染预防胃癌策略》报告指出，H.pylori感染可诱导慢性活动性胃炎缓慢进展为癌前病变，如萎缩性胃炎，肠上皮化生和发育异常，最后发展为胃癌。

CYP2C19是与PPI代谢最密切相关的细胞色素氧化酶，属于P450同工酶的亚型。由位于第10号染色体长臂上的CYP2C19等位基因编码表达，呈常染色体隐性单基因遗传特征[15-16]。到目前为止，已发现 CYP2C19 基因存在30余种等位基因，其中至少有20种突变等位基因影响其正常表达，致使CYP2C19酶的功能降低甚至丧失[17]。CYP2C19*1是具有催化活性的野生型正常等位基因，较为常见的突变等位基因主要有2个，即CYP2C19*2、CYP2C19*3[18-19]。基于CYP2 C19酶活性的差异，可将其分为三种代谢表型，即纯合子代谢型(野生型纯合子，*1/*1)、杂合子代谢型(野生型/突变型杂合子，*1/*2 或*1/*3)和慢代谢型(突变型纯合子，*2/*3 或*2/*2 或*3/*3)。CYP2C19 在人群中呈现出显著的基因多态性[20]。

在本研究中，观察组的CYP2C19基因分为纯合子快代谢型，杂合子快代谢和慢代谢型，三者发生率分别为32%、40%、28%；对照组以上3种类型分别为42%、46%、12%。两组间纯合子和杂合子快速代谢物的发生率无显着差异(P>0.05)。在慢代谢发生率的比较中，观察组显着低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示，CYP2C19的慢代谢型可能增加了H.pylori阳性患者患胃癌的风险性。

胃癌切除患者术后的有效性主要是以术后的生活质量作为主要评价标准，为了标准化胃癌手术切除后患者生活质量的评估，DAGCS32得以开发应用[6]。和肿瘤患者生活质量评价表相比，该评分系统更为统一和完善，可以更好地评判胃癌切除患者术后的有效性[21]。进一步，本研究统计远端切除术一年后两组患者DAGCS32得分，结果显示两组中纯合子快代谢型、杂合子快代谢与慢代谢型相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果表明CYP2C19的慢代谢型的得分显著低于其他两种基因型，预后较其他两种基因型差，提示CYP2C19的慢代谢型可能增加了胃癌手术术后功能障碍，影响了患者的预后。但是，由于许多因素会影响生活质量调查的结果，该研究仍有潜在的局限性。患者若在术后一年随访前死去，在分析时则会排除。这些患者的生活质量可能会很差，但却并没有考虑。因此，在未来的研究中需要扩大样本量已解决此问题。多种因素会影响患者DAGCS32的评分，因此该研究仍有潜在的局限性。如患者若在术后一年随访前死去，在分析时该患者的数据则会被排除，无法纳入分析。因此，在未来的研究中需要扩大样本量以解决此问题。

综上可知，慢代谢型增加了H.pylori阳性患者患胃癌的风险性，同时预后较纯合子快代谢型和杂合子快代谢型差，临床上应引起重视。