ADAM17在结肠癌细胞系中的表达及对增殖能力的影响

赵凤娟,宋淑莉,王志刚,姬永娟

结直肠癌是第三大常见癌症，也是癌症死亡的第三大原因[1]。预后与早期诊断密切相关，结直肠局部病变患者5年生存率高达90%，而伴随肿瘤转移的5年生存率降至13%[2]。有研究认为这种高死亡率是由于结肠直肠肿瘤细胞对常规化疗药物或靶向治疗药物产生了获得性抵抗[3]。 目前针对靶向治疗药物的预测性反应主要受突变状态的影响：抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体对肿瘤不含KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的患者有效[4]。解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17，又称肿瘤坏死因子-α转化酶，TACE)是新近发现的ADAM蛋白家族的成员之一，被认为可以在大多数组织中表达，并在炎症、肿瘤生长和血管生成过程中显著上调[5]，在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。因此，本研究拟通过检测ADAM17结肠癌细胞系中的表达，旨在初步探讨其在肿瘤增殖过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人结肠癌SW840、HT29、SW620细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。结肠癌组织来源于我院手术治疗所取得的病理标本。DMEM 培养基、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司，Trizol 试剂和逆转录试剂盒购自美国ThermoFisher公司，鼠抗人ADAM17单克隆抗体购自武汉优尔生商贸有限公司，鼠抗人GAPDH抗体购自美国Proteintech公司，即用型链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化超敏试剂盒(小鼠)购自福州迈新公司，二氨基联苯胺(DAB) 显色剂购自上海嵘崴达实业公司。慢病毒ADAM17-shRNA 购自上海吉玛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染

解冻人结肠癌SW480、SW620、HT29细胞株，接种于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞铺满培养瓶底80%以上时，酶消化备用。ADAM17小干扰RNA(ADAM17-shRNA)及对照序列由上海吉玛公司合成，将处于对数生长期的细胞接种到6孔板中，随机分为转染组(加入ADAM17-shRNA)、阴性对照组(加入无意义序列-shRNA 的慢病毒转染细胞)，和空白对照组(加入等量PBS)，48 h后荧光显微镜下观察转染效率。当MOI 值为80 时，表明细胞转染稳定表达。

1.2.2 荧光定量PCR检测

提取细胞总RNA并逆转录生成cDNA，引物均采用Primer 5 设计软件设计, ADAM17基因的上游引物序列为5’-AGAGCTGACCCAGATCCCAT-3’, 下游引物序列为5’-TACTCTCTTCCCCTCTGCCC-3’。内参照基因GAPDH 的上游引物序列为5’-CCCCTTCATTGACCTCAACT-3’,下游引物序列为5’-ATGAGTCCTTCCACGATACC-3’。qRT-PCR反应条件为：95 ℃预变性15 min,94 ℃15 s,55 ℃退火30 s, 70 ℃延伸30 s,40个循环。PCR目的产物大小213 bp，内参产物420 bp。采用 2-ΔΔCT法计算 ADAM17 mRNA相对表达量。

1.2.3 Western blot 检测

取12 μL PCR 反应产物于2%琼脂糖上电泳分析。将目的条带的灰度与内参条带GAPDH 的灰度比作为ADAM17的相对表达量。用5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h，加入一抗(1∶100稀释)，4 ℃下孵育过夜。用洗涤液(TBST)洗膜3次，加人辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h；再用TBST洗膜3次，最后用化学发光试剂发光，在凝胶成像系统上拍照分析。

1.2.4 细胞增殖能力比较

细胞转染72 h 后，用完全培养基重悬各组细胞，以1.5×104/孔接种于96孔板中，各组设8 个复孔。每孔滴加10 μL浓度为5 g/L的MTT溶液，细胞继续培养4 h后弃去培养基，每孔滴加100 μL二甲基亚砜，37 ℃静置15 min后，用酶标仪(570 nm波长)测定各孔吸光度(OD)值。

1.2.5 细胞周期观察

细胞转染72 h后，用PBS 缓冲液重悬细胞，加入预冷的70%乙醇2 mL充分悬浮细胞，置于4 ℃固定细胞24 h。加入含RNA 酶的碘化丙啶(PI)染色，常温下避光孵育30 min，上流式细胞仪测定细胞周期，并重复检测3次。

1.3 统计学方法

所有数据用SPSS 23.0统计学软件包完成，符从正态分布的计量资料采用进行描述，如方差齐，采用单因素方差分析及LSD-t法进行组间比较，如方差不齐选用近似方法(Welch法和Brown-forsythe法)。所有检验以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌细胞系中ADAM17的表达

所有细胞系均在局部表达ADAM17。SW480细胞系显示出ADAM17的高表达，SW620细胞系中尽管蛋白质印迹显示该蛋白的强带，但ADAM17的免疫组织化学表达显示较弱(见图1)。而且各细胞系中转染组的ADAM17 mRNA与蛋白表达均较显著低于阴性对照组和空白组(P均<0.05)。空白对照组和阴性对照组之间均无显著差异(P均>0.05),见表1、图2。

2.2 不同细胞系中ADAM17细胞增殖能力比较

HT29、SW480和SW620细胞系中转染组的细胞增殖能力均显著低于空白对照组和阴性对照组(P均<0.001)。HT29和SW480细胞系的空白对照组与阴性对照组之间无统计学差异(P>0.05)，但SW620细胞系中阴性对照组也显著高于空白对照组(P<0.001)。各细胞系之间比较，转染组在HT29的增殖能力显著低于SW480和SW620细胞系(P均<0.05),见表2。

图1 ADAM17在不同细胞系中的表达情况(HE染色200倍)

图2 ADAM17在不同细胞系中的蛋白表达

2.3 不同细胞系中细胞周期比较

在各细胞系中转染组处于静止期(G0/G1期)的比例均显著高于阴性对照组和空白对照组(P均<0.001)，表现为明显的G0/G1阻滞。处于G2/M期的比例显著低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)。空白对照组和阴性对照组在各细胞周期中的百分比无显著差异(P均>0.05),见表3。

3 讨论

既往研究证实ADAM17在结直肠癌中强烈表达，并与EGFR共同表达[6]。EGFR配体合成为跨膜前体细胞，可被细胞表面蛋白酶切割，特别是ADAM(去整合素和金属蛋白酶)家族的成员，ADAM将膜相关蛋白转化为可溶性效应物，同时迅速降低表面表达水平[7-8]。ADAM17/TACE(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转化酶)是一种膜结合酶，涉及EGFR和TNFR反式激活以及白细胞介素-6(IL-6)信号传导[9-10]。在食管鳞状细胞癌中高表达，其表达与肿瘤转移，淋巴结转移(TNM)分期有关[11]。此外，ADAM17与胃癌和非小细胞肺癌的预后不良有关，ADAM17过表达可诱导肺腺癌细胞增生[12-13]。并且既往研究已经证实ADAM17是EGFR轴的重要组成部分，癌基因KRAS通过ADAM17促进化疗诱导的生长因子凋亡、生长因子受体活化以及生成耐药性[14]。因此，本研究旨在评估ADAM17 对结肠癌细胞系中的表达及对增殖能力的影响来初步探讨ADAM17在肿瘤发展过程中的作用机制。

表1 不同细胞系中ADAM17mRNA与蛋白的表达

注：a采用Welch校正；与转染组比较，*P<0.05

表2 不同细胞系中OD值比较

注：a采用Welch校正；与转染组比较，*P<0.05；与HT29比较，#P<0.05

表3 不同细胞系中细胞周期分布(%)(n=3)

注：a采用Welch校正；与转染组比较，*P<0.05

本研究结果显示ADAM17 在结肠癌细胞系HT29，SW480和SW620细胞均有表达，但在SW620中表达较弱，这可能与不同抗体的敏感性有关。此外，转染后的ADAM17在各细胞系中均表现出明显的G0/G1阻滞能力下降，这与既往研究相似，均证明沉默ADAM17基因可以有效抑制肿瘤细胞的增殖[15-16]。尽管如此，目前有关ADAM17在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制尚不明确。研究认为ADAM17控制许多底物的释放，包括几种前EGFR配体[17]。尽管其他ADAM17和底物的作用在肿瘤发展方面仍然不确定，但越来越多的证据表明EGFR配体对结肠癌发展起重要作用[18-19]。既往研究认为ADAM17的定位和活性由4个半LIM结构域蛋白2(FHL2，一种参与多种蛋白质相互作用的LIM结构域蛋白)调节[20]。这种相互作用涉及到721-739位ADAM17的氨基酸序列。既往研究已经证实FHL2蛋白在结直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和卵巢癌中表达上调。高FHL2表达与结直肠癌的整体和无转移生存率密切有关。这种不良预后可能与FHL2在上皮细胞向间充质细胞转化中的作用有关，其中FHL2可以通过与Snail1(一种强效的EMT诱导剂)相互作用来调节E-钙粘蛋白转录[20-21]。并且研究也证实ADAM17/FHL2 信号轴在结直肠癌中比在腺瘤和正常结肠粘膜中更频繁，提示这些蛋白在结直肠癌发生的最后阶段相互作用[22]。此外，Reba Mustafi等利用结肠癌的遗传和化学模型，首次证明ADAM 17是调节EGFR配体释放的主要酶，具有促癌作用。并且发现CXCL12-CXCR4轴作为上游信号激活ADAM17，这为ADAM17作为结肠癌预防的潜在治疗靶点奠定了基础[23]。随着已鉴定的ADAM17底物的数量增加，有证据表明ADAM17几乎在每种细胞功能中发挥作用。

综上所述，结合既往研究和本研究我们认为ADAM17蛋白对结肠癌细胞的增殖具有促进作用，但是由于酶的普遍存在，对于控制ADAM17活性的机制仍需要进一步研究。