血清淀粉样蛋白A化学发光免疫检测技术开发

周齐洋, 黄建荣, 陈祥, 王春新

(1. 江苏省医疗器械检验所, 南京 210019； 2. 无锡市人民医院, 无锡 214000； 3. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室， 无锡 214122)

人血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A, SAA)是一组由同一基因编码的多形性蛋白，广泛地存在于各种脊椎动物中[1-2]。目前为止，共发现4种蛋白亚型，其中SAA1和SAA2蛋白结构93%一致，在炎症的急性期显著上调；SAA3为假基因，不能转录和表达蛋白；SAA4蛋白不参与急性炎症反应。在正常及炎症状态下，SAA1亚型为SAA蛋白的主要组分，决定着总SAA的水平[3]。血清SAA是一种敏感的急性期反应蛋白，正常情况下血浆中的含量极少，当机体受到细菌、支原体等抗原刺激后，在5～6 h内迅速升高约1000倍[4]。SAA还与高密度脂蛋白有关，它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢；其降解产物能以淀粉样蛋白A原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中产生严重的并发症。也有大量报道认为血清SAA水平可以作为评估和预测冠心病病情严重程度的敏感标志物[5-6]。随着该标志物的广泛研究和应用，其血清含量的检测方法及性能越来越受到重视。

目前血清SAA的检测方法主要为散射比浊法及胶乳免疫比浊法，该方法灵敏度较低，有一定的局限性。而化学发光免疫分析法因具有化学发光的灵敏度高、线性范围大和重复性好等优势，已成为体外诊断试剂的主流方法之一。

目前国内还鲜有关于SAA的化学发光检测方法的相关报道。本研究旨在采用双抗夹心法，建立一种高灵敏度、高重复性、高准确度的血清SAA化学发光检测方法。研究中使用了生物素-链霉亲和素信号放大的微孔包被板，将稀释后的含SAA的血清样本、生物素化抗体、酶结合抗体加入至孔内，孵育后洗涤去除杂质，加入发光底物，根据样本及校准曲线的光信号值计算相应样本中SAA的浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

化学发光板购于美国Costar公司。血清淀粉样蛋白A购于上海普欣；血清淀粉样蛋白A抗体对购于Meridian。150例人血清样本来自于无锡市人民医院；生物素化标记试剂购于Thermo Fisher；参比试剂为西门子医学诊断产品(上海)有限公司生产的血清淀粉样蛋白A 测定试剂盒(散射比浊法)。

1.2 仪器

安图公司产化学发光免疫分析仪，型号为LUMO。洗板机购于英国Anthos公司，型号为Fluido2。平板震荡仪购于上海汉林，型号为Mix-1500。生化培养箱购于上海坤天实验仪器有限公司，型号为SPX-80B。Quawell公司产超微量紫外分光光度计，型号为Q5000。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制备

1)制备生物素化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)。取10 mg BSA，加入到1 mL的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)中，加入1.69 mg生物素(分子量为556.59，间隔臂为22.4 Å)，充分混匀，室温偶联1 h。将标记好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermo脱盐柱中纯化脱盐，用磷酸缓冲液作为洗脱液，去除游离的生物素。

2)包被。用pH 7.0的磷酸盐缓冲液将上述Biotin-BSA稀释成6 μg/mL的包被液，每孔100 μL，4℃过夜。将包被液倒去，用洗液洗涤3次。加入15 μg/mL的链霉亲和素，每孔100 μL，室温孵育2 h。倒去孔内溶液后加入封闭液(含2% BSA的磷酸缓冲液)，200 μL每孔，室温孵育2 h。将封闭液倾去，晾干包被板。

1.3.2 生物素化抗体制备与纯化

取1 mg包被抗体，用脱盐柱更换缓冲液为磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)，最后收集到约1 mL的抗体溶液。准确称取NHS-LC-LC-Biotin 1 mg至1 mL的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)中。量取100 μL的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入至抗体溶液中，充分混匀，室温反应1 h。

将上述标记好生物素的抗体加入到脱盐柱纯化去除杂质。收集生物素抗体，测量生物素抗体在280 nm处的吸光度，计算蛋白回收率为91%。并以HABA试剂检验偶联率为7.2。

1.3.3 酶结合抗体制备与纯化

称取HRP溶于去离子水中，加入NaIO4(0.1 mol/L)溶液，室温条件避光搅拌20 min后将反应物于4 ℃冰箱中用醋酸钠溶液(1 mmol/L, pH 4.4)透析过夜，再加入4 μL乙二醇，室温避光反应30 min。加入SAA标记抗体，于碳酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 9.5)中4 ℃避光透析过夜，结合物加入0.1 mL NaBH4，混匀，4 ℃避光反应2 h，搅拌状态下加入等体积的饱和硫酸铵，4 ℃放置1 h， 5000 r/min离心15 min，弃上清。沉淀用PBS溶解，加入等体积甘油于-20 ℃保存[7]。

1.3.4 校准品的配制

用标准品稀释液(含2%人血清白蛋白，0.5%的2-氯乙酰胺，pH 7.6的磷酸缓冲液)将SAA抗原稀释成浓度分别为800、200、50、10、5和0 ng/mL的校准品溶液，分装，并于-80 ℃冻存。

1.3.5 生物素化抗体及酶结合抗体工作浓度的确定

采用棋盘滴定法[8]。以校准品1信号值较低且校准品6/校准品1比值最高时对应的浓度为最佳工作浓度。

1.3.6 反应时间确定

使用优化后的酶标抗体和生物素标记抗体浓度进行实验，以信号值基本接近或达到最高点，且重复性较好的反应时间为最佳反应时间。

1.3.7 实验原理及步骤

采用双抗体夹心法测定血清中SAA含量。首先将样本稀释400倍，在预包被了链霉亲和素的微孔板中，加入50 μL校准品或稀释后的血清样品后，再各加入50 μL生物素化抗体及酶结合抗体，混合后37 ℃孵育10 min，使生物素化抗体、SAA及酶结合抗体形成免疫复合物并与包被板上的链霉亲和素结合，洗涤去除未结合的杂质，加入100 μL化学发光底物后，用化学发光仪进行检测，根据样本及校准曲线的光信号值计算相应样本中SAA的浓度。

1.3.8 方法学评价

1)线性范围。取一份高值血清样本，用低值样本稀释成11个不同浓度，检测前进行400倍稀释后的浓度分别为822.42、412.84、206.58、104.92、54.08、28.67、15.96、9.60、6.43、4.84和3.25 ng/mL，各重复3次检测，取平均值。以样本浓度为X轴，以发光值为Y轴绘制曲线，取曲线拟合较好的区间为本方法的线性范围。

2)最低检测限。对校准品稀释液重复检测20次，计算20次发光值的平均值M和标准差SD，将M+2SD带入校准曲线方程，计算得到浓度值即为最低检测限。

3)准确度。对高值质控品和低值质控品分别重复检测3次，测量浓度结果的平均值记为(Mi)，根据公式(1)分别计算相对偏差(Bi)

Bi(%)=(Mi-T)/T×100%

(1)

式中：Bi为相对偏差；Mi为测量浓度的平均值；T为标定浓度。

4)精密度。取3批试剂盒，分别对高值质控品和低值质控品重复检测10次，计算CV=平均值/标准差。

5)加速稳定性。取同批次3盒试剂盒，置于37 ℃恒温箱中，分别在第1天、第4天及第7天取样，在第7天与4 ℃同批次试剂盒同时检测，以4 ℃同批次试剂盒为对照，考察质控品浓度偏差。

6)方法学对比。无锡市人民医院检验科选取覆盖线性范围的150例临床血清，分别用本文方法和西门子医学诊断产品(上海)有限公司生产的血清淀粉样蛋白A 测定试剂盒(散射比浊法)同时进行检测，并对血清检测结果进行统计学相关性分析。

2 结果

2.1 生物素化抗体及酶结合抗体工作浓度的确定

根据校准品1信号值较低且校准品6/校准品1比值最高的综合结果(表1)，确定生物素化抗体浓度为2 μg/mL，酶结合物抗体浓度为2 μg/mL。

表1 生物素化抗体和酶结合抗体工作浓度

2.2 反应时间确定

结果(表2和表3)表明，孵育10 min，信号值已基本达到最高值，且重复性较好，因此确定孵育时间为10 min。

表2 不同孵育时间对发光值的影响

表3 不同孵育时间对血清重复性的影响

2.3 线性范围

当试剂在3.25～822.42 ng/mL范围内时，剂量-反应曲线的线性良好，故确定检测方法的线性范围为5～800 ng/mL。

2.4 最低检测限

通过计算20份校准品稀释液的信号值结果，将M+2SD带入校准曲线方程，计算得到浓度值1.64 ng/mL。故拟定本方法最低检测限为3 ng/mL。

2.5 准确度

实验结果表明高低浓度质控品实测浓度与理论值之间的相对偏差绝对值分别为6.90%和2.83%，表明本方法检测准确性较高，见表4。

表4 准确度检测结果

2.6 精密度

3批次试剂盒各对低值质控品检测10次，批内变异系数分别4.8%、4.7%和2.3%，批间变异系数为4.2%。由此说明本试剂盒检测结果稳定，重复性好(见表5)。

表5 精密度检测结果

2.7 加速稳定性

检测结果(表5)显示试剂盒在37 ℃放置不同时间和4 ℃相比，质控品浓度偏差均小于10%，说明本试剂稳定性良好，结果见表6。

表6 加速稳定性试验结果

图1本法与西门子检测结果相关性

Figure 1 Linear correlation between the prepared method and Siemens kit

2.8 方法学相关性的比较

同时用本法与西门子试剂盒检测临床血清150份血清样本。分析计算相关系数r2=0.98，表明两种检测方法相关性较好(图1)。

3 讨论与结论

在目前的临床应用中，与C反应蛋白 (CRP) 类似，对血清淀粉样蛋白 A 的检测，有助于诊断炎症，同时检测 C 反应蛋白和血清淀粉样蛋白 A 能提高对感染的诊断灵敏度[9]，但血清淀粉样蛋白 A 检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，比 C 反应蛋白检测更确凿[10-11]。随着科研水平的进步，SAA标志物与疾病的关联报道越来越多，其诊断意义也越发显得重要。

本研究采用双抗夹心法原理，通过生物素-链霉亲和素的信号放大系统对血清淀粉样蛋白A进行定量检测。首先对重要原材料进行标记并通过棋盘滴定法确定其工作浓度，并对其反应体系进行优化；再对建立的方法做了相应的性能评估；最后将建立的方法与进口试剂盒进行临床样本测试比对。结果表明本研究建立的检测方法灵敏度、准确性、精密度以及稳定性等均能达到临床需求，该方法可为疾病诊断、预测以及治疗效果的判断提供客观诊断依据，同时也填补了目前国内相关研究的空白。