液基细胞学技术在肺结核诊断中的应用价值

孙逸敏 王振清 贾佳 谷化平

早期诊断和及时治疗在结核病防治中起关键作用，而提高诊断技术的检出率是早期发现患者的核心[1]。分枝杆菌涂片镜检作为最早的结核病实验室检查手段，目前仍是结核病检验方法学的基础，具有快速、方便、价廉的优势，对判断患者的传染性具有重要意义，但其阳性检出率较低[2]。液基细胞学技术(thinprep cytologic test，TCT)是一种将脱落细胞保存在液体中，通过机械、气动与流体力学原理，采用全自动设备将脱落细胞均匀分散地贴附于载玻片上的最优质、惟一获得美国食品药品监督管理局(FDA)认证的薄层制片技术，可大大减少阻碍视线的血液、黏液和炎细胞的数量，主要应用于宫颈、体腔积液、尿液、肛管直肠脱落细胞的检查[1]，对提高癌前病变检出率有重要意义；但目前用于检测结核分枝杆菌的报道较少[1]。笔者采用TCT检测初诊为疑似肺结核患者的不同类型标本(包括痰液、胸腔积液及支气管肺泡灌洗液标本)中分枝杆菌的阳性检出率及检测效能，为TCT的应用推广提供参考依据。

材料和方法

一、研究对象

搜集2017年11月至2019年2月河北省张家口市传染病医院诊治的符合纳入标准的248例初诊为疑似肺结核的患者。其中男133例(53.63%)，女115例(46.37%)；年龄12～85岁，平均(43.52±19.73)岁。由结核科医生根据相应临床表现及体征按照每例患者选用1种类型临床标本的原则共采集248份临床标本，包括101份晨痰标本(具有咳嗽、咳痰≥2周等呼吸道症状，或痰中带血或咯血)、67份胸腔积液标本(胸部CT平扫检查提示肺内浸润性病变伴胸腔积液)、80份支气管肺泡灌洗液标本(不明原因慢性持续性咳嗽、咳痰、喘鸣、声嘶及呼唤困难，痰标本抗酸杆菌阳性而肺部CT平扫未发现结核病灶)。最终通过临床综合诊断确诊为肺结核患者181例，非肺结核患者67例[包括肺炎43例、慢性阻塞性肺疾病(COPD)7例、支气管扩张8例、肺癌7例、未明确病因2例]。

所有入选患者均知情同意，并经医院伦理委员会批准；均行胸部CT平扫检查，提示肺内浸润性病变，考虑肺结核可能性大；均符合《WS 288—2017肺结核诊断》[3]标准，依据患者临床症状、体征、X线摄影检查、实验室检查、临床试验性抗结核药物治疗等临床综合诊断确诊；均未进行随访和使用抗结核药物治疗。

二、 检测技术与方法

对临床送检的每份痰液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液标本同时进行萋-尼抗酸染色涂片法镜检(Ziehl-Neelsen 染色涂片法镜检，简称“Z-N涂片法”)、TCT和BACTECTMMGIT 960分枝杆菌液体培养系统(简称“MGIT 960法”)检测。

1.Z-N涂片法：(1)痰标本直接按照《结核病实验室检验规程》[4]行Z-N染色涂片镜检(油镜 ×100)，可见细胞重叠，厚薄不均，红色为抗酸杆菌，蓝色为细胞碎片及黏液、纤维蛋白成分，染色结构模糊，整个视野仅偶见1小束分枝杆菌，记录镜检结果；(2)胸腔积液和支气管肺泡灌洗液标本首先静置2～4 h，再取20～50 ml沉淀物经3000×g离心20～30 min后，取离心后沉淀物1 ml参照文献[4]进行涂片、Z-N抗酸染色、镜检，记录结果。

2.TCT：(1)于生物安全柜中将痰标本加入至专用细胞保存液中静置15 min，若黏液较多则在痰标本中加入2～3 ml痰消化液(NALC-NaOH混合液，购自珠海贝索生物技术有限公司)；处理(具体方法依据珠海贝索生物技术有限公司提供的使用说明书)后震荡3 min进行液化，3000×g离心 5 min，弃上清液，取1 ml浓缩样本加入制片夹中，置于配套制片机内1500×g离心2 min；采用95%乙醇固定15 min后制片，再烘干玻片、Z-N抗酸染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，镜检(油镜 ×100)可见背景清晰干净，细菌均匀分布在载玻片上，且形态和结构保存良好，涂片未见血液、黏稠脓液、纤维蛋白成分，标本整个视野均是染色为红色的分枝杆菌，记录结果；(2)胸腔积液及支气管肺泡灌洗液均取50 ml送检标本，3000×g离心5 min，弃上清液，如有黏液加入等量NALC-NaOH消化液，取1 ml浓缩样本加入专用制片夹，余下制片步骤同痰标本，上镜观察，记录结果。

3. MGIT 960法：248份标本均按照MGIT 960全自动分枝杆菌液基检测系统(购自美国BD公司)说明书的规定进行检测。

三、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析，以临床诊断为标准计算Z-N涂片法、TCT、MGIT 960法的检测效能。3种检测方法计数资料间的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。注：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%

结 果

一、3种方法检测不同类型标本中分枝杆菌阳性率的比较

248份痰培养标本中，MGIT 960法检测的阳性标本为155份，包括晨痰82份、胸腔积液17份、支气管肺泡灌洗液56份。TCT检测总标本、痰液标本、胸腔积液标本、支气管肺泡灌洗液标本中分枝杆菌的阳性率(分别为53.63%、67.33%、17.91%、66.25%)均明显高于Z-N染色法(分别为25.81%、36.63%、7.46%、27.50%)(χ2=46.788，P=0.000；χ2=19.736，P=0.000；χ2=9.449，P=0.002；χ2=20.833，P=0.000)。但TCT检测痰标本的阳性率明显低于MGIT 960法，而胸腔积液及支气管肺泡灌洗液标本的检测结果相比较与MGIT 960法差异均无统计学意义，详见表1。

二、 TCT和Z-N染色法检测不同类型培养阳性标本中分枝杆菌阳性率的情况

TCT检测培养阳性的痰液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液标本中分枝杆菌的阳性率明显高于Z-N染色法(P值均<0.05)，详见表2。

三、3种方法对不同类型临床标本的检测效能

以临床诊断为参考标准，TCT检测所有临床标本的敏感度[72.93%(132/181)]和一致率[79.84%(198/248)]均明显高于Z-N染色法[分别为30.39%(55/181)、48.79%(121/248)]，但明显低于MGIT 960法[分别为85.64%(155/181)、89.52%(222/248)]。三者特异度接近[分别为98.51%(66/67)、98.51%(66/67)、100.00%(67/67)]，详见表3。

表1 不同类型标本采用3种方法检测的分枝杆菌阳性率比较

注括号外数值为“标本份数”，括号内数值为“构成比(%)”；a：为TCT与MGIT 960法检测阳性率的比较；b：为Z-N染色法与MGIT 960法检测阳性率的比较

表2 不同类型培养阳性标本采用TCT和Z-N染色法检测的分枝杆菌阳性率比较

注括号外数值为“标本份数”，括号内数值为“构成比(%)”

表3 以临床诊断为参考标准评价3种方法的检测效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%

讨 论

结核病是由结核分枝杆菌感染引发的全身多系统疾病，以肺结核多见[5]，是严重危害人类健康的全球性呼吸系统传染病[6]。早期准确诊断是结核病患者得以及时治疗的关键，而提高诊断技术对早期发现结核病患者至关重要。我国基层结核病实验室承担着主要的肺结核患者发现工作，但对肺结核患者的检测手段极其有限，尽管结核分枝杆菌培养技术仍是结核病诊断的“金标准”[7]，敏感度较高，但获得结果的时间较长(2～6周)[8]，不利于及时发现和治疗患者[9]。因此，基于传统涂片法(标本涂片染色后显微镜下形态学检查)简单、快速、成本低的优势[10]，目前仍是基层结核病实验室广泛使用的结核病诊断技术[11-13]。但由于传统涂片法是手工将体液沉淀物推涂在玻片上，厚薄不一，难以去除细胞碎片、血液、黏液等成分，导致视野模糊不清，且当分枝杆菌菌量偏少时也难以通过镜检发现，导致其敏感度和特异度不高[8]；加之涂片技术存在盲目取材、标本利用率不高，涂片过大、过厚，存在大量的红细胞、黏液，导致观察者视觉疲劳，干扰诊断。为提高传统涂片法的敏感度，研究者不断对其进行优化[14]。

TCT是近年来应用于临床细胞病理学诊断的一种新技术，其优于传统涂片法的特点如下：(1)具有标本保存功能。采用专用细胞保存液对标本进行解黏、消化处理，可保证标本新鲜完好，且去除了标本中的黏液、细胞碎片、纤维蛋白、脓液等的干扰，使背景清晰干净，细胞及细菌均匀分布在载玻片上，且形态和结构保存良好；(2)标本利用率高。该技术对保存在液基瓶内的标本可以制作多张涂片，符合不丢弃任何所选材料的原则[12]。对同一标本也可以进行多项检查，如目前广泛应用的细胞病理学检测、细胞免疫化学、以及分子生物学检测等，可以满足临床诊断需要，是TCT的显著特点；(3)涂片技术进一步改进。由于无人为的涂抹、牵拉、挤压，且通过配套制片机甩片，涂片无血液、黏稠脓液、纤维蛋白成分，可将细胞、细菌均匀地分布在载玻片上，无重叠、损伤、变形；并因除去了标本中的黏液、细胞碎片、纤维蛋白、脓液等的干扰，使背景清晰干净，易于观察鉴别，可最大限度提取标本制片，增加细菌呈现量[11]，在保证原有染色性能的基础上，明显提高了涂片质量、阳性检出率和诊断能力；(4)涂片标准化。TCT可使分枝杆菌染色涂片达到标准化，降低了因在涂片和染色过程中不按程序规范操作导致的结果差异，可作为满足室内及室间质量控制的需要和患者诊断回顾性分析的依据[13]。但值得注意是，TCT在检测痰标本时，需对标本进行前处理、离心沉淀、专用制片机甩片，致其成本支出增高、检测耗时较长，对于痰标本检测量大的实验室，可能会影响阅片效率和检验费用，需综合考虑其应用价值；但对于胸腔积液及支气管肺泡灌洗液标本则不存在这些问题，其操作仍较传统方法简便、快速，阳性检出率高，有利于临床快速准确诊断。

本研究结果显示，TCT无论用于所有疑似肺结核标本还是分枝杆菌培养阳性标本，其检测痰液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液标本的阳性率均明显高于Z-N染色法，尤其可明显提高涂片抗酸染色“++”以下标本的阳性检出率，且检测支气管肺泡灌洗液标本的阳性率更为明显。由于涂阴肺结核患者常少痰甚至无痰，不合格的痰标本可明显影响其检测结果，而支气管肺泡灌洗液直接取材于病变部位，加之纤维支气管镜检查的“激惹”作用和冲洗，可明显增加获得分枝杆菌的机会，因此对于痰菌含量少(无痰或少痰)或菌阴者、肺部病灶局限、与引流支气管不相通、肺结核病灶暂时稳定的患者，可采集支气管肺泡灌洗液检测[15-17]。

本研究以临床诊断为标准，应用TCT、Z-N染色法、MGIT 960法三种方法检测不同类型临床标本中的分枝杆菌，TCT检测的敏感度、一致率明显高于Z-N染色法，但低于MGIT 960法，与相关报道结果相似[2]。进一步说明尽管目前Z-N染色法仍是基层医院发现分枝杆菌的重要手段，但直接涂片法的标本质量差，直接影响到涂片的制片、染色效果，从而降低分枝杆菌的阳性检出率和敏感度[18]；而TCT可以有效减少操作人员的操作误差，实现涂片的标准化和最大化有效利用标本，特别是对于荷菌量少的标本，可明显提高分枝杆菌的阳性检出率和敏感度，且阳性率与MGIT 960法相当。

近年来，一些新的技术如分子生物学技术开始应用于病理学诊断[19]，如通过检测病理标本中结核分枝杆菌及其DNA来进行结核病与非结核分枝杆菌病的鉴别，或通过检测标本中结核分枝杆菌的抗原或抗体进行诊断等[20-21]。这些技术在一定程度上提高了结核病病理学诊断的准确率，为病理学的发展提供了新方向，但由于分子生物学技术费用较高，且对实验室环境及工作人员水平要求也高，在基层医院难以开展[22]。而TCT从标本收集、保存、制片、诊断等方面均较传统涂片法有了重大改进和提高，尤其在检测不同类型体液标本时，其操作简单、快速，阳性率高，易于临床推广，更适用于基层单位，对肺结核快速准确诊断具有重要的临床应用价值。