山东省猪瘟Erns 基因系统进化分析与表达模式的研究

兰邹然，张 月，楚遵锋，徐淑华，田夫林，王金宝

(1.山东省动物疫病预防与控制中心,山东 济南250022；2.山东省农业厅,山东 济南250002)

猪瘟(CSF)为黄病毒科瘟病毒属成员,是严重危害养猪业的传染病之一,传染性很强,致死率较高,给养猪业造成巨大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将此病列为A 类传染病之一[1]。世界上,包括亚洲、欧洲、中南美洲、部分非洲等许多国家采取了大规模的疫苗防控跟净化措施,但是猪瘟仍然普遍存在[2]。20 世纪20 年代我国首次对该病进行了报道,此后的几十年里,疫情接连不断的发生。1954 年,Zhou 等[3]研发的猪瘟兔化弱毒疫苗虽然较好地控制了猪瘟在我国的广泛流行,但20世纪70 年代末,我国包括山东省等多个省份仍就受到该病的危害。

猪瘟病毒为单股正链RNA 病毒,基因组大约12.5 kb,由一个大的ORF 编码一个3 898 个氨基酸的多聚蛋白。该蛋白在细胞内蛋白酶和病毒特异性的蛋白酶作用下裂解成各种成熟的结构蛋白(S)和非结构蛋白(NS)。从N 端开始至C 端各蛋白质分别是Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B。其中,Erns和E2 是其主要的保护性抗原,且Erns具有RNase 酶活性,成为研究抗猪瘟病毒药物重要的靶基因[4]。

全球猪瘟流行性病学调查对研究猪瘟病毒的起源与消灭起很大的作用。过去,多数研究是针对E2 基因。台湾的猪瘟的流行性病学调查指明Erns和E2 具有相似的系统进化树,且Erns比E2 在进化上更保守些[5]。本研究就是想通过对Erns的研究,进一步揭示山东省猪瘟病毒在中国以及全球猪瘟病毒系统进化中地位。

1 材料与方法

1.1 菌种及质粒 E.coli Top10,购自生工生物工程(上海)股份有限公司；P.pastoris GS115 和P.pastoris 整合型分泌达质粒pPIC9K 由山东省农业科学院家禽研究所赠送。

1.2 试剂与工具酶 酵母完全培养基(YPD)、选择培养基(MD)、甲醇选择培养基(MM)、诱导培养基(BMGY)和甲醇诱导培养基(BMMY)按Invitrogen 公司说明书配制；Plasmid Miniprep kit 和Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 以及各种限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ和T4 DNA 连接酶Ex taq 酶,购自TaKaRa 公司；Tryptone Yeast 为OXOID 产品；YNB 为Solarbio 产品。

DL-2 000 DNA Marker、低分子质量蛋白质Marker,购自 TaKaRa 公司；四甲基氨基甲烷(TEMED)D-山梨醇等,购自Promega 公司；过氧化物酶标记的二抗等为Sigma 公司产品；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 病毒和细胞 采集山东省疑似猪瘟病料,包括淋巴结、肾脏、脾脏等,用GenBank 公布的引物[6]HCV-1:5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′；HCV-2:5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′开展RT-PCR检测。将检测为阳性的病料按照Liu,J.J 的方法[12]接种PK-15 细胞。

1.4 RT-PCR 和Erns基因的克隆 取带毒细胞液200 μL,参照TRLZol Reagent 试剂说明书进行总RNA 的提取,空气中自然干燥。用疫苗毒和灭菌水做阳性和阴性对照。

Erns基因的DNA 合成参照TIANGEN 的Quant One Step RT-PCR Kit 说明书进行。Erns基因的特异性引物为E0-1:(5′-GAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′)； E0-2: 5′-ACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。PCR 反应体系为50 μL,反应条件为10×RT-PCR Buffer(5 μL),10 mmol/L dNTP Mixture each(2 μL),5×RT-PCR enhancer(10 μL),20 U RNasin,2.25 U Hotmaster Taq polymerase,Quant RTase for one step(0.5 μL),primer E0-1(10 μmol/L)(3 μL),primer E0-2(10 μmol/L)(3 μL),RNA(template)(1μg),ddH2O(23.5 μL)。一步法程序是:50 ℃(30 min),94 ℃(2 min),94 ℃(35 cycles 30 s),线性化53 ℃(30 s),延伸65 ℃(1 min),最终延伸65 ℃(10 min)。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

阳性PCR 产物用TIANGEN 公司的胶回收试剂盒回收并取4.0 μL 回收产物按TaKaRa 公司pMD18-T vector 说明书克隆入T 载体,经初步鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 序列与系统进化分析 分析测序结果,获得Erns基因的全长cDNA 序列,并对该序列进行生物信息学的分析,例如信号肽和糖基化位点预测。此外该序列经NCBI BLAST 程序比对后,预测它的保守结构域,并寻找同源基因的存在。用DNASTAR 软件包中的MegAlign 程序分析36 株参考毒株的蛋白质序列之间的相似性和趋异进化程度。序列比较的方法为CLUSTAL W 方法。采用Mega3.1 邻接法(Neighbor-joining Method)构建了系统进化树。利用TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)软件分析其是否含有跨膜区。

1.6 pPIC9K-Erns基因重组质粒构建 设计合成重组质粒的特异性引物并扩增Erns基因,在5′端加EcoR Ⅰ位点,3′端加NotⅠ位点,引物序列如下:E0-3:5′-CGGAATTCGAAAATATAACTCAATGGAACCTG-3′和E0-4:5′-ATTTGCGGCCGCACAGTAAGGCGATAGGGC-3′。将Erns基因及pPIC9K 质粒载体均用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶双切,琼脂糖电泳,回收酶切片段；将双酶切后的Erns基因片段及pPIC9K 片段用T4 DNA 连接酶进行连接；连接产物转化感受态Top 10(AMP+),用含AMP+的LB 平板筛选阳性重组子,通过酶切PCR 和测序等方法鉴定阳性克隆。

1.7 目的蛋白的诱导表达 将重组表达质粒pPIC9K-Erns和空质粒pPIC9K 用SalⅠ酶切线性化,将其电转化到Pichi apastoris GS115 酵母感受态中,取400 μL 铺于YPD 平板上,28 培养3 d 挑选生长良好的单菌落接种于2 mL YPD 培养过夜后,取新鲜的菌液3 μL 进行PCR 鉴定,选特异性引物:AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；AOX2:5′-GCAA ATGGCATTCTGACATCC-3′,阳性菌落再利用G418 对Mut 型进行筛选。

选取PCR 鉴定且经过筛选正确的重组菌接种至含10 mL YPD 培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)的试管中,30 ℃,200 r/min 振荡培养过夜；次日以1%的比例(V∶V)接种至含100 mL BMGY 培养基(1.34%YNB、4×10-7生物素、10%甘油、1%酵母提取物、2%蛋白胨、5%甘油)的500 mL 三角瓶中,30 ℃,200 r/min 振荡培养约24 h；离心并将菌体重悬于BMMY 培养基(1.34%YNB 4×10-7生物素、1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇)中,28 ℃,200 r/min 振荡诱导表达4 d,每隔24 h 补加100%甲醇至终浓度为0.5%,按时间段取样进行分析。

将工程酵母菌在BMMY 培养基中诱导培养一定时间后,离心分别收集沉淀和上清,并将培养上清用硫酸铵沉淀法初步纯化,用2 倍上样缓冲液与沉淀和纯化的上清蛋白等量混合进行SDS-PAGE 试验,以分析目的蛋白的表达。

1.8 蛋白印迹(Western-Blot)检测 将SDS-PAGE的电泳产物转移至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂乳封闭。用CSFV 阳性猪血清进行Western-Blot 检测。

2 结果与分析

2.1 Erns基因扩增产物的鉴定 我们从山东省猪瘟病毒株 SDCQ 中得到了 Erns基因(序列号:JQ911701),该cDNA 克隆全长为696 bp(图1),编码一个232 个氨基酸的蛋白质,其理论分子量为50 kDa。其蛋白质具有RNA 酶的活性,包含一个RNase T2 结构域。

图1 Erns基因的片段扩增

2.2 序列与系统进化分析 经NCBI 里的BLAST 和SMART program(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析发现,该cDNA 编码的蛋白质比较保守,有RNase T2 保 守 结 构 域。 TMHMM server v.2.0(Http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)软件分析表明,Erns不具有跨膜区。对SDCQ 株Erns基因编码的蛋白与其他36 株参考毒株的Erns基因编码的蛋白进行系统进化分析发现:这些毒株分为两个基因群,4 个亚群(图2),SDCQ 株属于Subgroup 1.1a,此亚群是有德国株Paderborn、3 个台湾毒株和7 个国内株组成的,同源性在93%～99%之间,由此可以推测该亚群病毒拥有共同的祖先；与Subgroup 1.1b的同源性在91%～92%之间；而与Group2 中参考序列的同源性比较在84%～86%之间(见图2)。五个疫苗株:LPC/AHRI(Taiwan),HCLV(China),Riems(Holland),Chinese C strain 和Chinese vaccine strain 聚集在一起,与Pan 等[5]之前研究得出的结论一致。值得注意的是,SDCQ 并没有与国内外经典的具有代表意义的毒株聚集在一起,由此可知,山东省内流行的CSFV 毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在一定差异。

图2 36 株CSFV Erns基因系统进化树

分析SDCQ 和其他19 个参考毒株的氨基酸序列,Erns具有两个保守区(CRs),分别位于aa 28 ～36和75 ～82 区域(图3)。流行毒株与疫苗株在CR1 区域存在差异,位于36 位点的氨基酸E 被G 所取代。由此引出一个有趣的问题:此变化是否带来毒力的变化?序列中位于30 位和79 位的H(组氨酸)为RNase 催化活性关键氨基酸残基,此位点高度保守[6]。

2.3 pPIC9K/Erns重组质粒与重组酵母菌的筛选

对重组质粒进行PCR 和双酶切鉴定。PCR 结果显示,有与目的基因相符的696 bp 大小的条带；然后双酶切其质粒,电泳结果显示两条带,分别为9 kp 左右和696 bp(图4A),阳性质粒测序结果证明,Erns基因已正确插入pPIC9K 的多克隆位点上。

将电转化后的菌落作为模板,AOX1 和AOX2为引物,进行PCR 检测,电泳结果显示1 173 bp 大小的条带(图4B),与目的产物大小相符,阳性重组菌测序结果证明,pPIC9K/Erns重组质粒正确整合入酵母菌中。

图3 20 株CSFV Erns氨基酸序列分析

图4 重组质粒与重组菌的鉴定

2.4 Erns基因表达产物的SDS-PAGE 和Western Blot 分析 将筛选的转化子分别接种BMGY 和BMMY 培养基诱导表达后,将表达上清透析、浓缩后进行SDS-PA GE 结果显示,GS115/ pPIC9K-Erns转化子诱导产物在50 kD 处出现与预计的以同源二聚体形式存在的Erns大小相符的条带(图5A),与Western-Blot 结果显示一致(图5B),重组蛋白Erns可被CSFV 多抗血清识别,且显示两条杂交条带。这一结果与van Gennip 等[7]研究结果相吻合。

图5 表达产物SDS-PAGE 电泳及Western-Blot 分析

3 讨论

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性接触传染性病毒病,对养猪业危害严重。猪瘟病毒是一种具有囊膜的单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科瘟病毒属。 其基因组包含一个大的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码一种由约3 898 个氨基酸残基组成的多聚体蛋白,该多聚体蛋白在病毒和细胞酶作用下加工成4 种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和8 种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)。

Erns是猪瘟病毒所有蛋白中比较特殊的一种囊膜糖蛋白,只存在于黄病毒科的瘟病毒属,是一种高度糖基化的蛋白。糖蛋白分子量约占Erns总蛋白分子量的二分之一。在感染细胞中Erns在内质网内积累,并可存在于病毒粒子表面或被分泌到胞外。所以,Erns蛋白很难在常用的细菌系统中获得有活性的蛋白。毕赤酵母(Picha pastoris)是一种甲醇营养型酵母,能够在以甲醇作为单一碳源的培养基上生长,既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作的特点,又具有真核生物的蛋白质加工、折叠、翻译后修饰的优点,同时其遗传比较稳定,能够密度发酵,蛋白的表达量高、且易于纯化,因此,毕赤酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型,是表达外源基因比较理想的宿主。

本试验从山东省猪瘟病毒株SDCQ 中扩增到了Erns基因全长696 bp,通过构建系统进化树发现SDCQ 并没有与国内外经典的具有代表意义的毒株聚集在一起,由此可知,山东省内流行的CSFV 毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在较大差异。序列分析发现,流行毒株与疫苗株在CR1 区域存在差异,位于36 位点的氨基酸E 被G 所取代,是否因此带来毒力的变化,还需进一步证实。通过构建pPIC9K-Erns重组质粒,成功转化和筛选到一株多拷贝的工程酵母菌,通过甲醇诱导培养分泌表达了一定量的Erns蛋白。Western-Blot 分析结果表明,表达的Erns蛋白能识别天然猪瘟多克隆抗体,具有生物学活性,同时证实Erns是以同源二聚体的形式存在。下一步试验将大量诱导Erns蛋白,收集表达产物,经过纯化以期得到高产量蛋白,为基因工程疫苗和检测试验的研究奠定基础。