SRC-3 在犬乳腺癌中的表达及分析

王华南，卫顺生，高聪聪，马 文，裴世敏，杨 旭，张 迪，金艺鹏，林德贵

(1.浙江大学动物科学学院动物医学系,浙江 杭州310058；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所,山西 太原030032；3.中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193)

乳腺肿瘤是母犬最为常见的肿瘤,其发病率约占母犬全部肿瘤性疾病的25%～42%,因此在兽医临床上对犬乳腺肿瘤进行明确诊断、治疗和判断预后是从事兽医行业的人们不懈探索的目标[1]。研究发现,肿瘤组织中的类固醇激素与肿瘤的预后、化疗耐药性等密切相关[2]。

类固醇激素通过与ER、PR、AR、GR 等在内的类固醇受体结合,进而调控乳腺肿瘤的生长[3]。类固醇激素与受体的结合则需要类固醇受体辅助活化因子-3(Steroid receptor activation factor 3,SRC-3)的调控,一旦SRC-3 异常表达,会高度激活下游很多癌基因信号通路的激活,导致肿瘤的发生[4]。

SRC-3 最早在人乳腺癌细胞系中发现,与乳腺癌的发生、恶性程度及预后具有相关性[5、6]。还有研究表明,SRC-3 与卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤的发生均密切相关[5,7-9],所以SRC-3 已成为导致肿瘤发生的一个癌基因。而国内外还未见报道SRC-3 在犬乳腺癌中的表达情况,因此本研究有助于我们更好地评价其对犬乳腺肿瘤的预后作用。

1 材料与方法

1.1 动物材料 选取2011 年至2014 年中国农业大学教学动物医院收集的犬乳腺肿瘤组织,根据WHO 的分类标准,68 例犬组织分为28 例良性乳腺肿瘤、40 例恶性乳腺肿瘤(包括/例淋巴结转移)。无菌手术器械对肿瘤不同部位进行取材,无菌生理盐水冲洗后,用十倍体积的4%中性甲醛固定液固定。

1.2 主要试剂及仪器 兔抗人SRC-3 单克隆抗体工作液(Santa 公司)；克隆系C-10；DAB 显色试剂盒和PV-9000 通用型二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；自动脱水机、半自动石蜡包埋机、手动切片机、恒温展片机(英国Shandon 公司)。

1.3 试验方法 对所有收集到的乳腺肿瘤组织进行SRC-3 免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法参照文献。简要步骤如下:将上述固定的乳腺组织用组织包埋机进行石蜡包埋；每个石蜡组织至少制备2 张3 μm 的切片；第一张切片制备H&E,进行病理学分类；另一张组织切片经过脱蜡、水化、修复抗原、封闭、加一抗、加二抗、显色等过程完成SRC-3 的免疫组织化学染色。

1.4 结果判定标准及分析方法 SRC-3 表达以细胞核出现黄褐色为阳性反应。在400 倍显微镜下观察并计数。根据染色细胞占比例可分为5 级。0分:＜5%,1 分:5%～25%,2 分:26%～50%,3 分:51%～75%,4 分:＞75%。根据显色程度判断阳性强度:标本无着色为0 分；淡黄色为1 分；棕黄色为2 分；棕褐色为3 分。 两者分数乘积0 ～2 分为(-)；3-4分为(+)；6 ～8 分为(++)；8 分以上为(+++)。“-”与“+”为低表达,“++”与“+++”为高表达。每份切片计分=细胞染色数分数×染色强度分数,所得分数＜1 为阴性结果,反之为阳性。

采用SPSS 11.0 及PPMS 1.5 统计学软件进行数据处理,数据间比较采用卡方检验和H 检验,相关性采用Spearman 等级相关分析。P ＜0.05 为统计学显著性差异。

2 结果

如中插彩版图1(A 和B)中所示,SRC-3 主要表达于细胞核,少部分在细胞质中表达。SRC-3 在41例乳腺癌中均有表达,但表达的程度有较大差异。恶性乳腺肿瘤的表达率为77.5%高于其他类型的乳腺组织(35.7%),表达情况有一定差异(见表1)。

3 讨论

SRC 家族是辅助激活因子的一类,目前已知的包括3 种:SRC-1、SRC-2、SRC-3。SRC-3 是最先在乳腺癌中发现的一种基因,它在很多的组织中都有表达,但在乳腺和卵巢中的表达量最高[5]。它以配体依赖的形式与核受体相互作用,通过受体的甲基化反应或乙酰基化反应以及其他一些辅助因子的参与来提高核受体基因的转录活性[4]。SRC 蛋白家族主要对类固醇受体如雌激素受体、孕激素受体、甲状腺素受体以及糖皮质激素受体等发挥转录调节作用,对机体的生长、发育以及生殖具有重要的影响[4]。人类研究证实,SRC-3 蛋白表达与肌层浸润深度具有明显的相关性,说明过度表达的SRC-3 可能参与细胞的异常生长增殖,对肿瘤的形成及其局部侵袭能力具有一定的促进作用[10-11]。因此我们可以认为,肿瘤组织中SRC-3 表达水平越高,其深肌层浸润的可能性越大,因为肌层浸润深度是乳腺肿瘤预后不良的因素之一,可以结合其他预后不良的高危因素综合判断预后及指导临床治疗。

表1 SRC-3 的表达情况

人类癌症研究中发现,SRC-3 蛋白在ER 阳性的乳腺肿瘤中的表达量明显地高于ER 阴性的乳腺肿瘤,说明虽然SRC-3 蛋白的异常表达能够通过多种途径导致肿瘤的发生,但在雌激素敏感的乳癌肿瘤中,雌激素受体途径应该在肿瘤的癌变过程中发挥重要作用[12]。我们只研究了SRC-3 在犬乳腺肿瘤中的表达情况,并且SRC-3 主要在恶性乳腺癌中高表达,主要表达于乳腺细胞质和细胞核中,而我们本次试验并未分析SRC-3 与ER 之间的关系,但并未我们将来研究SRC-3 与ER 所涉及的信号机制做了基础工作。

SRC-3 在犬正常组织中无表达,但是在肿瘤组织中有表达,其中SRC-3 在部分恶性肿瘤表达明显,适用于作为早期判断恶性程度指标及预后指标；筛选出SRC-3 强表达的乳腺肿瘤组织对于后续的研究可能有一定的意义。