应用病毒计数仪定量检测口蹄疫灭活抗原方法的建立

杨小蓉，严 石，许 磊，马 良

(1.中牧实业股份有限公司,北京 丰台100070；2.农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室,北京 海淀100095；3.北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术研究中心,北京 海淀100095)

口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染的疫病,主要发生在牛、羊、猪等偶蹄动物,被世界动物卫生组织(OIE)列为A 类传染病[1]。疫苗的质量是防控该疫病的重点,抗原含量则决定了疫苗免疫效力[2-4]。我国目前使用的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗,其安全性和有效性是防控口蹄疫的关键。口蹄疫灭活抗原的检测目前主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S 检测,通过146S 检测的本质是完整病毒的相对物理含量[5]。但该方法操作过程繁琐,操作时间太长,一次能检测样品数量有限,检测效率不高。现有的免疫学方法检测口蹄疫病毒抗原含量,是针对抗原表位,若抗原位点组成有变化,使用该检测方法可能有误差。即病毒碎片的某些抗原表位只要存在就能被检测出,因此,非完整病毒也能被计数。在动物免疫试验中发现,某些抗原位点不完整对机体免疫水平刺激有限,产生的抗体水平甚至达不到保护效果[6]。建立快速、准确、操作简单、批量操作的口蹄疫灭活病毒抗原定量检测方法提高疫苗生产厂家对于疫苗质量的控制能力,对高效疫苗的研发具有重要意义。

本试验采用病毒计数仪对口蹄疫灭活病毒粒子进行定量检测,耗时短,只需10 min,准确性较高、受干扰因素少,对口蹄疫疫苗的产品质量控制提供了较好的方法储备。

1 材料与方法

1.1 试验材料 5 份口蹄疫灭活抗原,平均分为A、B 两组,A 组用于病毒计数仪检测,B 组用于蔗糖密度梯度146S 检测,样品均由中牧实业股份有限公司兰州生物制药厂提供；超速离心机,购自BECKMAN 公司；分光光度计,购自紫外可见尤尼柯(上海)仪器有限公司；ViroCyt 病毒计数仪和病毒计数染色试剂盒(Virus Counter Reagent Kit),均购自艾贝泰公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒计数仪检测

1.2.1.1 病毒样品染色 将A 组5 份灭活抗原样品在室温下用14 000 r/min 离心10 min,收集上清用于计数检测；将20 μL 上清液加入到180 μL 的Sample Dilution Buffer 中；将Combo Dye 工作液混匀,加100 μL 到200 μL 上述样品管中；将样品管盖子盖上,彻底震荡混匀；室温放置30 min,避光染色；染色完的样品在等待检测过程中,保持避光。

1.2.1.2 病毒样品检测 打开病毒计数仪,进行自动清洗。依次完成ISW 液体管、CVF 液体管检验,待显示“Passed”后,换上PVS 液体管；选择“PVS”按钮并显示“Successful”后,即可进行灭活抗原样品的检测。再依次ISW 液体管、CVF 液体管检验并显示“Passed”后,装上待检样品,选择“Start Analysis”按钮,开始分析样品,并显示“Collecting Data”。

待检测完成后,保存数据,卸下样品管。再依次ISW 液体管、CVF 液体管检验并显示“Passed”后,即可检测第2 个样品。直至第3 份样品检测完后,清洗管道并关机[4]。

1.2.2 口蹄疫灭活抗原146S 检测 将B 组口蹄疫灭活抗原样品,经反复冻融3 次后,置-20 ℃冰箱中,备用；以5 000 r/min 离心15 min,获取上清夜,然后再20 000 r/min 高速离心30 min 后取上清夜；接着以100 000 r/min 超速离心2 h,将沉淀用少量PBS 溶解；在离心管中依次加入15%,25%,35%,45%蔗糖,加的时候用长针头从底部往上加的；在超速离心管中加入第3 步所获取的含抗原样品,110 000 r/min 离心2.5 h,发现在25%附近有一条明亮的带,用长针头将不同部位的带都吸取出来,分别收集到不同的瓶内；检测用分光光度计测定各样品病毒含量[5]。

2 结果与分析

2.1 病毒计数仪检测结果 利用病毒计数仪对A组5 份口蹄疫灭活抗原每个样品浓度的检测均重复3 次,平均值分别是6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL,其变异系数范围为1.15%～3.57%,说明该方法成立,且结果可靠。

表1 病毒计数仪检测结果

2.2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 检测结果 利用蔗糖密度梯度法对B 组5 份口蹄疫灭活抗原每个样品浓度的检测均重复3 次,平均值分别是5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL和4.42×108VP/mL,其变异系数范围为1.48%～5.08%,说明该方法结果可靠。

表2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 检测结果

3 讨论

为了比较146S 方法和病毒计数仪方法检测病毒含量的特点,选择5 份口蹄疫灭活抗原平均分为A 组、B 组(来自同一批次样品)进行平行检测。对于A 组5 份口蹄疫灭活抗原样品,病毒计数仪检测结果平均值分别为6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL。对于B 组5 份口蹄疫灭活抗原样品,蔗糖密度梯度法检测146S 结果平均值则为5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL 和4.42×108VP/mL。该两种方法都是为了检测病毒完整粒子。B 组的检测结果普遍比A 组高一些,均属正常,这是由于方法原理不同造成的系统误差。

蔗糖密度梯度法检测146S 原理是,不同颗粒之间存在沉降系数差时,在离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法,病毒完整粒子在特定的密度梯度区带。在样品存在杂蛋白的情况下,蔗糖密度梯度法的特定密度梯度区带除了病毒完整粒子外,有可能存在杂蛋白,因此与病毒具有同样沉降系数的杂蛋白也会计数为病毒粒子。因此蔗糖密度梯度法检测口蹄疫146S 抗原,对仪器设备要求较高,操作繁琐,耗时长,不能进行大批量检测。如果样品纯化不够、杂蛋白偏高,由于杂蛋白的影响,蔗糖密度梯度法检测口蹄疫146S 抗原则存在检测结果偏高的可能。

而病毒计数仪检测原理是,核酸和病毒衣壳蛋白都同时被染色、并且同时通过计数孔的时候,就计数1 个病毒粒子。病毒计数仪检测病毒不受杂蛋白影响,因此,结果也更准确。

在动物疫病的预防和治疗中,总病毒颗粒的定量检测对于病毒疫苗的生产和研究均十分重要,而病毒计数仪10 min 就能快速检测到病毒的总浓度,优势明显[6-7]。因此,病毒计数仪定量检测病毒抗原耗时短、受干扰因素少、准确性较高,对口蹄疫疫苗的产品质量控制提供了一种可采用的方法。