荧光PCR技术在酿酒酵母细胞测定中的应用

申　敏

荧光PCR技术在酿酒酵母细胞测定中的应用

申敏

（长治职业技术学院山西长治046000）

聚合酶反应（PCR）作为一种敏感特意的核酸分子定性检测的方法，在基因诊断中有着重要的作用，可是传统PCR技术存在着诸多无法攻陷的难关，比如PCR后需要进行手工操作，无法定量，PCR产物容易污染等。随着科技的发展，实时PCR技术诞生，有效的解决了传统PCR技术的弊端，实现了定量分析，因此其被广泛的用于食品工程中。文章采用实时荧光PCR技术应用于测定果汁中酿酒酵母细胞的含量，确立了一种实时荧光PCR检测方法，提高了检测的准确性，提升了检测效率。

荧光PCR技术；酿酒酵母细胞；DNA

实时荧光PCR技术是将传统PCR技术为基础，逐渐发展而来的一种核酸定量技术，其被用于细胞研究中，是一种常见的细胞研究方式。借助荧光PCR技术能够更加立体而又直观的观察肉眼所及的生命现象。当前，实时荧光PCR技术被普遍用于转基因成分、动植物病毒、临床样品以及微生物等不同生物成分的检测。笔者将实时荧光PCR技术用于探测果汁中的酿酒酵母细胞的含量，提升了检测效率，明确了检测方法的灵敏度与特异性。

1 材料和方法

1.1 材料和设备

基因提取试剂盒、ABI7300 型荧光PCR仪。

1.2 实验方法

测定酿酒酵母的检出下限。温度：28 ℃；时间：24 h。在1ml培养液中采用酵母基因组提取试剂盒提取其中的DNA，将提取出来的DNA进行稀释。同时，选择七份均为1ml的培养液，标号1、2、3……7，其中培养液1为原液，培养液2-7以10 、100 、1000 ……的倍率稀释，利用倾注平板法计算培养液中的菌落数量，为了提升计数的准确性，不同培养液重复计算两次。

测定果汁样品中酿酒酵母的检出下限。把1 ml的酿酒酵母培养液接种在20 ml的苹果汁、橙汁以及葡萄汁中。培养场所：生化培养箱；温度：30 ℃；时间：48 h。采用酵母基因组提取盒在1ml果汁培养液中提取酿酒酵母DNA，将提取出的DNA溶液分成七份，分别标号a、b、c……g，分别以10 、100 、1 000 ……的倍率进行稀释处理，利用实时荧光技术对果汁中所存在的酿酒酵母进行检出下限测定。同时选取1ml果汁培养液从10-1以10 倍稀释度的方法一直稀释到10-6，不同稀释度分别选取1ml的培养液，采用倾注平板法对菌落进行计数，不同的稀释度要进行两次重复试验，验证结果的准确性。

2 结果与分析

测定不同浓度酿酒酵母DNA溶液的检出下限，从图1可知，不同浓度的DNA溶液都能够获得扩增曲线，而采用无菌双蒸水作为空白对照进行测定，则不存在扩增曲线。有结果可知，培养液中酿酒酵母浓度是7×105cfu/mL。

图1　实施荧光纤维技术测定酿酒酵母检出下限

注：1-8是原液、不同浓度溶液以及空白组扩增曲线。

果汁中酿酒酵母的测定结果如图2所示，不论是原液还是稀释到不同的浓度，都存在显著的扩增曲线，无菌双蒸水空白组没有出现扩增。最终结果表明，酿酒酵母在苹果汁、橙汁、葡萄汁中的浓度分别是1.2×106、7×105、1.6×106cfu/mL。

图2　酿酒酵母在橙汁中检出下限

注：1-9分别为橙汁DNA原液、不同浓度、空白对照组扩增曲线。

图3　酿酒酵母在苹果汁中的检出下限

注：1-9分别为苹果汁DNA原液、不同浓度、空白对照组扩增曲线。

本研究试图构建一种快速的果汁酿酒酵母荧光纤维检测方法，采用这种方法对样本当中的酿酒酵母进行检测，整个过程只需要5h，可以及时的反映过程中样本、环境的污染情况，为生产进程中产品质量控制提供了有效而又快速的检测方法。

[1]曹春蕾,曹正锋,赵运英.荧光显微技术在酿酒酵母细胞研究中的应用[J].基因组学与应用生物学,2018,37(4):1539-1546.

[2]洪志强,方梅,陆巧荣.实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用[J].现代预防医学,2010,37(2):346-348.

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.05.31

申敏（1987- ），女，山西潞城人，硕士，研究方向：食品生物技术。

Q932

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2095-1205(2019)05-54-02