PTEN基因对急性淋巴细胞白血病细胞增殖、侵袭及迁移的影响

李晓丽,赵艳辉

(1 本溪市中心医院，辽宁本溪 117000；2 武警辽宁总队医院 )

急性淋巴细胞白血病 (ALL)是临床常见血液恶性肿瘤，发病率为1.7/10万[1]，儿童2～5岁、成人50岁以后为高发年龄阶段。ALL的治疗有传统化学疗法及新型疗法如单克隆抗体、免疫疗法和其他靶向治疗等。目前以上治疗方法对于儿童患者效果较好，5年和10年总生存率分别为(80.0±1.2)%和(76.3±1.6)%，而对于成年患者，治愈率仅为20%～40%[2]。ALL是克隆性疾病，肿瘤细胞在增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制下大量累积在体内[3]；同时，ALL细胞具有高侵袭性，ALL的恶性行为与细胞增殖、侵袭等密不可分[4]。研究显示，10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因蛋白(PTEN)是抑癌因子，对肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移有重要影响，在多种肿瘤中表达下调[5]，其中ALL患者也有PTEN表达下调的研究报告[6]。2015年6月～2017年6月，我们首先检测PTEN mRNA在ALL患者外周血中的表达水平，并采用过表达和沉默PTEN两种技术，从正反两方面研究PTEN对ALL细胞增殖、侵袭和迁移的影响及作用机制，旨在获得PTEN是治疗ALL潜在分子靶点的依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本溪市中心医院确诊为ALL患者50例及体检健康人20例外周血各2 mL。逆转录、qRT-PCR试剂盒，购自日本TaKaRa公司；ALL细胞系CEM-C1、CCRF-CEM、Jurkat和人T淋巴细胞系 H9，购自美国ATCC细胞库；DMEM、RPMI-1640培养基及胎牛血清，购自美国Gibco公司；PTEN过表达和沉默病毒，由上海吉玛生物有限公司包装合成；蛋白裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒，购自美国Thermo公司；MTS，购自上海碧云天公司；Boyden基质胶，购自美国BD公司；Transwell小室、6孔板、培养瓶等耗材，购自美国corning公司；兔抗人p-p38MAPK抗体、鼠抗人GAPDH抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 PTEN mRNA表达检测 设计PTEN引物F:5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′, R:5′-GGTGGGTTATG GTCTTCAAAAGG-3′；内参GAPDH引物F: 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′, R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。RNA提取试剂盒提取外周血或细胞中总RNA，以总RNA反转录的cDNA作为模板进行qRT-PCR，获得各样品的循环阈值(Ct)；采用2-ΔΔCt法分析实验数据，检测PTEN mRNA的表达。所有被检者均签署知情同意书，标本收集操作均符合医院伦理委员会规定。

1.3 PTEN蛋白表达检测 采用Western-blotting法。收集ALL细胞系各类细胞，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液。采用超声冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min离心30 min，上清液为提取的细胞蛋白，BCA检测蛋白浓度。加入loading buffer煮沸变性后电泳分离蛋白，采用湿转转膜，8%脱脂牛奶室温封闭3 h，加入目的基因一抗孵育4 ℃过夜或常温3 h，TBST洗涤3次后，二抗室温孵育2 h，ECL化学发光显示条带。

1.4 细胞培养及病毒感染 ALL细胞系CEM-C1用含10%FBS的DMEM培养、CCRF-CEM和Jurkat用含10%FBS的RPMI-1640培养，人T淋巴细胞系 H9用含10%FBS的RPMI-1640培养，培养条件为37 ℃、5% CO2。将呈对数生长期的CCRF-CEM细胞铺至6孔板中，分为对照组、过表达组、沉默组，将对照、过表达PTEN病毒、沉默PTEN病毒以复感染指数20分别感染各组细胞，放至培养箱中培养。

1.5 细胞增殖能力检测 收集各组细胞，以每孔2.5×103个细胞、100 μL培养基接种于96孔板中，每组每天6个复孔，共4 d，放至细胞培养箱中培养，分别在对应时间每孔加入20 μL MTS工作液，培养箱中孵育2 h后，酶标仪在波长490 nm处测取每孔的吸光度OD值。

1.6 细胞侵袭能力检测 收集各组细胞，以每孔2.5×103个细胞、100 μL培养基接种于Transwell小室上室的基质胶上，下室加500 μL的含10% FBS的培养基作为诱导趋化因子，放至培养箱中培养。显微镜观察掉入下室细胞超过10个左右时终止培养，PBS洗3次后甲醇固定10 min，苏木素染色，取出小室的聚碳酸酯微孔膜，显微镜下随机计数3个视野穿过的细胞数目。

1.7 细胞迁移能力检测 收集各组细胞，以每孔5×105个细胞、2 mL培养基接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，10 μL的枪头沿直尺方向划两条直线划痕，PBS将划掉的细胞洗净后，加入无血清培养基培养。显微镜下拍照观察24 h细胞迁移的情况。

2 结果

2.1 ALL患者外周血及ALL细胞系PTEN mRNA表达 外周血PTEN mRNA表达ALL患者(1.37±0.54)低于健康人(1.04±0.47)，差异有统计学意义(P=0.022)。见图1A。PTEN mRNA在ALL细胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat中的表达水平低于人T淋巴细胞系H9中的表达，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1B。

图1 ALL患者外周血及ALL细胞系PTEN mRNA表达

2.2 ALL细胞系PTEN 蛋白表达 PTEN蛋白在ALL细胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat细胞中的表达低于人T淋巴细胞系H9中的表达(图2A)。与对照组相比，PTEN蛋白在PTEN过表达组增加，在PTEN沉默组减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)(图2B)。

图2 ALL细胞系PTEN 蛋白表达

2.3 PTEN对CCRF-CEM细胞增殖能力的影响 与对照组相比，PTEN过表达组细胞增殖能力降低，PTEN沉默组细胞增殖能力增强，差异均有统计学意义(P均<0.05)(图3)。

图3 PTEN对CCRF-CEM细胞增殖能力的影响

2.4 PTEN对CCRF-CEM细胞侵袭能力的影响 与对照组相比，PTEN过表达组细胞侵袭能力减弱，PTEN沉默组细胞侵袭能力增强，差异均有统计学意义(P均<0.05)(图4)。

图4 PTEN对CCRF-CEM细胞侵袭能力的影响

2.5 PTEN对CCRF-CEM细胞迁移能力的影响 对照组、PTEN过表达组和PTEN沉默组划痕愈合比分别为(15.79±0.61)%、(6.11±0.30)%和(26.11±0.30)%。与对照组相比，PTEN过表达组细胞迁移能力减弱，PTEN沉默组细胞迁移能力增强，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.6 PTEN 对p38MAPK信号通路的影响 与对照组相比，PTEN过表达组和PTEN沉默组细胞中p38MAPK蛋白的表达均无差异(P均>0.05)；与对照组相比，PTEN过表达组细胞中p-p38MAPK蛋白表达增加，PTEN沉默组细胞中p-p38MAPK蛋白表达减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)(图5)。

图5 PTEN对p38MAPK信号通路的影响

3 讨论

ALL是T细胞和B细胞谱系的祖细胞异常转化产生大量未成熟的早期白细胞，并聚集在骨髓中抑制正常造血功能，同时可以侵入外周血进入全身循环[2]。化疗的应用可以提高ALL患者的缓解率和延长生存时间，但对于复发和难治性ALL患者效果不佳，其中复发性ALL是导致患者死亡的主要原因[7]；此外，化学药物的重大毒性仍然是患者生活质量降低的主要因素[8]，因此寻找ALL新的治疗方法十分重要。目前，分子靶向药物治疗肺癌、肝癌等实体瘤已取得了较好效果[9]。但是ALL的发病机制尚不明确，其分子靶向药物疗法广受限制。研究报道，表观遗传和遗传畸变是ALL的致病因素，癌基因和抑癌基因的改变在ALL的发生发展中发挥重要作用[10]。

PTEN定位于染色体10q23.3，全长5.572 kb，是最重要的抑癌基因之一。有学者[11]首次报告PTEN在多种人类肿瘤中具有高频率的突变，包括原发性胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤细胞系、前列腺癌细胞系和乳腺癌细胞系。PTEN基因突变、丢失及体细胞失活等是引起肿瘤等相关疾病的潜在原因。Paganin等[12]报告257例患有T细胞急性淋巴细胞白血病的儿童中31例存在PTEN突变，并且PTEN突变与复发风险增加显著相关。同时PTEN可以编码多种特殊的蛋白质，在调节正常细胞生长、增殖及抑制肿瘤细胞周期进展、促进肿瘤细胞凋亡方面发挥重要作用。有报道PTEN调节FAK和Akt磷酸化水平诱导膀胱癌细胞的凋亡[13]。PTEN可以作为多种miRNAs的直接靶基因、癌基因和抑癌基因的下游基因参与肿瘤的恶性进展，miR-106b通过直接靶向PTEN促进了食管鳞状细胞癌细胞EC-1和EC9706的增殖、侵袭和转移[14]。DUXAP10 在慢性粒细胞白血病组织和细胞中高表达，可通过抑制PTEN的表达减少细胞凋亡[15]PTEN mRNA和蛋白在ALL新诊断及复发患者外周血中的表达水平均显著低于正常和缓解患者中的表达水平[6]。

本研究显示，PTEN mRNA在ALL患者外周血的表达水平显著低于对照健康人，在ALL细胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat中的表达水平均显著低于人T淋巴细胞系H9。此结果与Ren等[6]报告一致。ALL患者血液和细胞系中PTEN表达降低提示其可能为抑癌基因。我们进一步采用过表达和沉默慢病毒感染CCRF-CEM细胞使其过表达和沉默PTEN表达后，检测PTEN在ALL细胞中的生物学功能，发现过表达PTEN组细胞增殖、侵袭、迁移能力均下降，沉默PTEN组细胞增殖、侵袭、迁移能力均增强，表明PTEN具有抑制ALL细胞增殖、侵袭和迁移的生物功能。

PTEN是具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性的抑癌基因。PTEN的N端185个氨基酸具有脂质磷酸酶活性，可以将磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PIP3)的D3位去磷酸为PIP2，使PIP3的作用减弱，从而抑制PI3K/Akt信号通路，诱导细胞阻滞在G1期，促进细胞侵袭和转移。PTEN的C端218个氨基酸具有磷酸化位点，可以脱去磷酸丝/苏氨酸、磷酸酪氨酸的磷酸基团，负调控MAPK信号通路，抑制肿瘤的恶性生物学行为。PTEN在肿瘤中抑制PI3K/Akt信号发挥作用的研究较多[16]，MAPK在ALL中异常激活。p38MAPK是MAPKs家族中的重要亚型，与肝癌、肺癌等常见肿瘤的发生发展密切相关。p38MAPK发生磷酸化成为p-p38MAPK可发挥重要生物学作用，p-p38MAPK表达升高能抑制急性早幼粒细胞白血病的细胞增殖[17]。本研究结果显示，与对照组相比，过表达PTEN组和沉默PTEN组细胞中p38MAPK的表达均无明显差异，过表达PTEN组细胞中p-p38MAPK蛋白表达增高，沉默PTEN组细胞中p-p38MAPK蛋白表达降低，说明PTEN可能通过激活p38MAPK信号通路发挥抑制ALL增殖、侵袭和迁移的作用。