X射线交错互补修复基因3在胶质瘤中的表达及临床意义

张墨轩，冯帆，潘景臻，崔洪玮，张健，刘伟

(1 潍坊医学院，潍坊261053；2 临沂市人民医院)

胶质瘤是中枢神经系统最常见、最具侵袭性的肿瘤，约占颅内肿瘤的40%[1]。根据WHO分类，胶质瘤病理分级为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级[2]。近年来，虽然胶质瘤的总体治疗效果有了显著提高，但是高等级胶质瘤患者的平均预期寿命仍仅有14个月[3]。因此，进一步探讨胶质瘤的发生机制及其治疗新靶点是提高胶质瘤患者生存率的迫切需要。X射线交错互补修复基因3(XRCC3)参与同源重组修复途径(HRR)，是癌症易感性高度可疑候选基因[4]。最新文献报道，XRCC3在膀胱癌、乳腺癌和结肠直肠癌等肿瘤的发生发展中起着重要作用[5,6]。然而，XRCC3在胶质瘤中的表达差异及其与预后的关系尚不清楚。为此，本研究对胶质瘤中XRCC3的表达及其意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年7月～2014年7月临沂市人民医院住院治疗的胶质瘤患者肿瘤标本65例，男35例、女30例，中位年龄44岁；患者均为首次手术治疗，胶质瘤诊断均经病理检查证实。肿瘤大小：直径≥4 cm 51例，<4 cm 14例；肿瘤部位：位于额叶35例，颞叶19例，其他11例；胶质瘤KPS评分：<80分34例，≥80分31例；WHO病理分级：Ⅰ～Ⅱ级31例，Ⅲ～Ⅳ级34例。另选取同期在临沂市人民医院因创伤性脑损伤行颅内减压术获得的正常脑组织标本10例及瘤旁证实为正常脑组织标本30例进行对照研究。本研究获医院伦理委员会批准通过。

1.2 胶质瘤及正常脑组织XRCC3表达检测 将65例胶质瘤组织及40例正常脑组织在中性缓冲甲醛溶液中固定24 h，后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋处理。将石蜡包埋的胶质瘤标本及正常脑组织标本切成3 μ m厚的切片，随后石蜡切片在70 ℃下烘烤1 h，二甲苯脱蜡并用顺浓度梯度乙醇水化。脱蜡水化后的切片在10 mmol/L柠檬酸缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)中微波加热进行抗原修复，修复后自然冷却至室温。滴加阻断内源性过氧化物酶(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育10 min并用PBS缓冲液冲洗3次，1次2 min。用正常山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)封闭10 min，倾去封闭液后滴加单克隆抗XRCC3抗体(武汉三鹰生物技术有限公司, 1∶100)在4 ℃过夜，PBS缓冲液冲洗3次，1次2 min。滴加抗鼠/兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)在室温下孵育30 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育10 min，PBS缓冲液冲洗3次，1次2 min。加入适量新鲜配制的DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温暗箱孵育3～5 min，加水终止显色，流动水冲洗，苏木素、盐酸乙醇分化液和氨水返蓝复染，最后行脱水、透明、封片处理。每个样本通过免疫组化着色强度和阳性细胞百分比进行评估。阳性肿瘤细胞的百分比评分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>76%为4分。染色强度分为四个等级(强度评分)：阴性(0分)、浅棕色(1分)、棕色(2分)、棕褐色(3分)。将强度评分和百分比评分相乘产生得分，得分≤4分定义为XRCC3低表达，得分>4分定义为XRCC3高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。计数资料以百分比表示，采用χ2检验分析XRCC3表达与临床病理特征的相关性，采用Kaplan-Meier分析胶质瘤XRCC3表达与生存时间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XRCC3在胶质瘤组织中表达上调 免疫组化染色显示，XRCC3在胶质瘤组织和正常脑组织表达主要位于细胞质中，细胞核表达较弱。见图1。正常脑组织XRCC3高表达率为20.0%(8/40)，胶质瘤组织XRCC3高表达率为50.8%(33/65)，二者XRCC3高表达率差异有统计学意义(P=0.017)。

注：A 正常脑组织；B Ⅱ级胶质瘤组织；C Ⅳ级胶质瘤组织；D 阴性对照(未加一抗)。

图1XRCC3在不同等级胶质瘤中表达情况(免疫组化染色，×200)

2.2 XRCC3表达与胶质瘤患者临床特点的关系 单因素分析显示XRCC3的表达与性别、年龄、肿瘤直径、发病部位、KPS评分等因素无关(P均>0.05)。Ⅲ～Ⅳ 级胶质瘤XRCC3高表达率高于Ⅰ～Ⅱ 级胶质瘤，差异有统计学意义(P=0.019)。见表1。

2.3 XRCC3的表达与胶质瘤患者预后之间的关系 65例患者均进行了跟踪随访，根据XRCC3表达差异与患者生存时间绘制Kaplan-Meier生存曲线(图2)。显示XRCC3低表达生存时间6～108(68±3.08)个月，XRCC3高表达生存时间1～97(24±7.10)个月，两者生存时间比较差异有统计学意义(P=0.003)。

表1 胶质瘤组织XRCC3表达与临床特点的关系[例(%)]

图2 不同XRCC3表达水平胶质瘤患者生存曲线

3 讨论

近年来，尽管有研究者不断发现与胶质瘤形成、入侵、进展以及患者预后有关的分子标志物如IDH突变、MGMT启动子甲基化、染色体lp / 19q杂合性缺失和TERT启动子突变等[8]，但是对胶质瘤发生的确切机制仍了解不多，临床缺少胶质瘤有效治疗方法是大家的普遍共识。目前，在哺乳动物细胞中人们已经发现了4种成熟的DNA修复途径，分别是核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复和双链断裂修复[9]。DNA双链断裂是最常见和最危险的DNA损伤类型，可导致细胞基因组不稳定，进而导致肿瘤发生和进展[10,11]。DNA双链断裂具有2种主要的修复方式，即同源重组修复和非同源末端连接[7]。同源重组修复是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。DNA双链断裂后基因组完整性的修复是细胞抵御环境损伤的主要手段。DNA双链断裂一旦被错误修复，可导致细胞染色体异常，引发细胞向恶性转化，最终导致肿瘤的发生[12]。

作为细胞应对环境破坏的主要防御手段，DNA修复对维持基因组的完整性至关重要。从理论上讲，DNA修复蛋白表达的减少或丢失会破坏DNA修复能力，导致基因组不稳定，从而增加对肿瘤的易感性。然而，在肿瘤发生过程中，DNA修复蛋白的表达变化相当复杂，有些表达下调，有些表达上调。XRCC3是参与同源修复通路中的核心蛋白之一，其基因位于人类染色体14q32.3，编码DNA修复蛋白[11]。XRCC3蛋白是人类RAD51的同源蛋白，在同源重组修复通路中通过与其他蛋白相互作用有效修复DNA损伤[13]。目前，已在多种肿瘤组织中检测到XRCC3异常表达。如在结直肠癌中XRCC3多态性与结直肠癌的易感性相关[14]，在乳腺癌中XRCC3与RAD51的表达呈正相关并在肿瘤中呈高表达状态[10]。本研究显示XRCC3在胶质瘤组织中高表达率为50.8%，远远高于正常脑组织，提示XRCC3可能参与胶质瘤的发生发展进程。

文献报告，XRCC3对替莫唑胺导致的胶质母细胞瘤细胞DNA双键断裂有修复作用，参与胶质母细胞瘤的化疗耐药形成过程[2]。但是，胶质瘤XRCC3表达与患者临床特点及肿瘤分级的关系未见报道。本研究发现，XRCC3表达与胶质瘤患者性别、年龄、肿瘤大小、发病部位及KPS评分无明显相关性；Ⅲ～Ⅳ 级胶质瘤XRCC3高表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ 级胶质瘤，XRCC3在胶质瘤中的表达与病理分级相关。有研究显示，食管鳞癌患者XRCC3表达与放化疗耐药有关，XRCC3高表达患者生存期较短[15]；肝细胞癌患者XRCC3多态性与预后相关，XRCC3 Thr/Met和Met/Met基因型患者中位生存时间较短[16]。本研究显示，胶质瘤XRCC3高表达者生存时间缩短，XRCC3高表达与胶质瘤预后不良相关。

综上所述，XRCC3在胶质瘤中呈高表达，病理分级越高表达越高，且高表达患者预后较差，提示XRCC3可能是胶质瘤的1个新型诊断标志物、预后预测因子及药物治疗靶点。