极光激酶A通过调控Wnt信号通路影响胃癌细胞增殖和侵袭

魏晓东，刘 茜，唐艳萍

胃癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居我国恶性肿瘤发病率和死亡率第二[1]。胃癌早期诊断率低、治疗效果差、5年生存率低是目前胃癌治疗面临的严峻形势，其发病机制尚不明确，仍是目前重要的研究课题。极光激酶A（Aurora Kinase A，AURKA）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是极光激酶家族成员之一[2]。在有丝分裂中，AURKA通过参与中心体的分离和成熟以及纺锤体两级的建立，确保有丝分裂中染色体的正确分离和胞质分裂的完成，在细胞周期中起重要作用[3]。AURKA的异常扩增和/或高表达常见于多种胃和食管腺癌[4]。近年来的研究提示，AURKA可参与Wnt等重要的细胞信号通路，作为激酶直接或间接地调节一些重要蛋白的表达，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[5-6]。Wnt信号通路是生物体内重要的生存信号通路，主要通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关[7-8]。为研究胃癌分子病理学机制、寻找以AURKA和EMT（Epithelial Mesenchymal Transition）为对象的治疗靶点提供新的思路。因此本研究通过应用小干扰RNA技术探索AURKA对胃癌细胞SGC-7901增殖侵袭的调控，并分析该基因对胃癌细胞EMT的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料 AURKA小分子抑制剂MLN8237购自美国Selleckchem公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司，荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养 人胃癌细胞系SGC-7901购自中国科学院上海生命科学院研究院，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养。

1.3 分组及细胞处理 小分子抑制剂MLN8237使用DMSO溶解为浓度为20 mmol/L的储存液-20 ℃保存，实验分为对照组（DMSO对照处理）和实验组（MLN8237储存液处理），对照组和实验组内DMSO终浓度为0.1%；实验组加入药物MLN823溶液，使终浓度为20 μmol/L；继续处理细胞24 h进行后续实验。

1.4 MTT法检测细胞增殖速率 将处于生长对数期的SGC-7901细胞以4000个/孔细胞的密度接种于96孔板内，接种24 h后，加入浓度为20 mmol/L的MLN8237使得其作用浓度分别为2、4、10、20、40、80 μmol/L。作用24 h后，每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37 ℃培养 4 h。移除上清液，每孔加入200 μL的DMSO后震荡混匀15 min，至完全溶解，用酶标仪在492 nm波长下测定吸光值，记录OD值，确定的IC50为20 μmol/L。取对数生长期的SGC-7901细胞以4000个/孔细胞接种于96孔板内，接种24 h后，实验组加入20 mmol/L的MLN8237工作液使最后作用浓度为20 μmol/L，对照组加入等体积的DMSO溶液。作用24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃培养4 h，同上处理，细胞破碎后用酶标仪在492 nm波长下测定吸光值，记录OD值，每隔24 h收集一次并检测，绘制细胞生长曲线。细胞增殖速率（%）=各检测时间点细胞数/接种细胞数×100%。上述实验重复3次。

1.5 实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达取对照组和实验组细胞，加入Trizol，使细胞完全裂解，采用Trizol法提取RNA。依照试剂盒说明书进行逆转录，逆转录条件：42 ℃ 60 min，65℃ 10 min，反应产物cDNA作为模板，PCR检测AURKA基因表达。PCR条件：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40 个循环；72 ℃ 5 min。GAPDH的引物序列：上游引物：5’-TGTGGGC ATCAATGGATTTGG-3’，下游引物：5’-ACACCAT GTATTCCGGGTCAAT-3’；AURKA的引物序列：上游引物：5’-CAGACTGGATACCGGGACC- 3’，下游引物：5’-CTTCAGCACGTTTTTGCACTG-3’；β-catenin的引物序列：上游引物：5’-AAAGCGG CTGTT AGTCACTGG-3’，下游引物：5’-CGAGTC ATTGCATACTGTCCAT-3’；N-cadherin上游引物：5’-TTTGATGGA GGTCTCCTAACACC-3’，下游引物：5’-ACGTTTAACACGTTGGAAATGTG-3’；E-cadherin上 游 引 物：5’-CG AGAGCTACAC GTTCACGG-3’，下游引物：5’-GGGTGTCGAGGG AAAAATAGG-3’；Twist上 游 引 物：5’-GC CTAGAGTTGCCGACTTATG-3’，下游引物：5’-TGCGTTTCCTGTTAAGGTAGC-3’； 以 GAPDH作为内参，按照2-△△Ct法进行计算分析。

1.6 Western blotting检测蛋白表达 取步骤1.3中的细胞，加入含PMSF的RIPA试剂提取蛋白，运用BCA法进行蛋白定量。每孔上样量为30 μg，以SDS-PAGE分离蛋白后，电转移至PVDF膜上，用含5%的脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液（TBST）室温封闭1 h，加入1:1000稀释的兔抗人AURKA多克隆IgG抗体、兔抗人β-catenin多克隆IgG抗体、兔抗人N-cadherin多克隆IgG抗体、兔抗人Twist多克隆IgG抗体、兔抗人E-cadherin多克隆IgG抗体和兔抗人GAPDH多克隆IgG抗体，4 ℃孵育过夜；PBST洗膜3次后，加入HRP标记的羊抗兔二抗（1:1000），室温孵育60 min；PBST洗膜3次后，加入化学发光试剂发光液后用成像仪显影。上述实验重复3次。

1.7 细胞周期检测 收集MLN8237或DMSO处理后的细胞，加入预冷的500 μ L 75%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中固定过夜，离心后弃去乙醇溶液，用PBS洗涤两次后收集细胞，加入300 μ L的碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液，避光染色20 min，弃去染液，PBS洗涤2次，置于流式细胞仪（美国，BD FACSCalibur）中，在488 nm波长下检测细胞周期分布情况。上述实验重复3次。

1.8 Transwell细胞侵袭实验测定细胞侵袭能力 在Transwell小室上层加入60 μ L Matrigel基质胶（按Matrigel：DMEM=1:2配置），将小室置于24孔板内于37 ℃培养箱内30 min待基质胶凝固，小室上层加入SGC-7901细胞（10×105个/mL），小室下层加入600 μ L含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养箱内培养48 h后取出，弃去小室内细胞，用棉签轻轻擦掉基质胶和未穿过膜的细胞，用PBS洗涤后用结晶紫溶液染色5 min。100×显微镜下观察并记录细胞数量，取3个随机视野平均数为每组穿过小室的细胞数。上述实验重复3次。

1.9 平板克隆实验 各组细胞消化后进行细胞计数，转移至6孔板内，500个/孔，常规培养14 d。显微镜下观察克隆形成情况，除去培养基后用PBS清洗，每孔加入多聚甲醛1 mL固定细胞10min，除去固定液，加入结晶紫染色10 min，用PBS反复浸洗除去染液颜色，空气干燥，显微镜下观察并计数，大于50个细胞的细胞团计为一个克隆，克隆形成率（%）=（克隆数/500）×100%。上述实验重复3次。

1.10 统计学方法 应用SPSS17.0对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差示，采用方差分析方法和t检验对实验结果进行分析。P＜0.05时认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 MNL8237作用后的细胞增殖情况 运用MTT法确定MLN8237作用于SGC-7901的IC50为20 μmol/L。见图1A。同时检测MNL8237对胃癌细胞SGC-7901细胞生长的影响，绘制生长曲线，运用方差分析结果显示，实验组细胞生长速度较对照组明显减慢，提示MNL8237对胃癌细胞增殖有明显抑制作用（P＜0.05）。见图1B。

2.2 各组细胞内AURKA和EMT相关基因和蛋白表达情况 相比于对照组（1.00±0.13），实验组细胞中AURKA（0.36±0.09）的mRNA水平明显降低，β-catenin（0.41±0.07）、N-cadherin（0.26±0.08）、Twist（0.33±0.12） 的 mRNA 水平降低，而 E-cadherin（4.05±0.96）的 mRNA水平上调，且两组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）（ 图 2）。Western blotting结 果 显示，MLN8237降低了SGC-7901细胞中AURKA、β-catenin、N-cadherin、Twist蛋白水平，增加了E-cadherin蛋白水平。结果进一步说明，MLN8237可以通过调控β-catenin来抑制胃癌细胞EMT过程。见图2。

图1 MTT法检测的细胞增殖变化

图2 RT-PCR和Western blotting检测MLN8237对SGC-7901细胞内AURKA、β-catenin、N-cadherin、Twist、E-cadherin的mRNA和蛋白影响

2.3 MLN8237处理细胞后细胞周期分布情况 结果显示实验组与对照组相比出现了明显的细胞G2/M期阻滞（P＜0.05）。见图3、表1。

图3 MLN8237处理后SGC-7901细胞出现G2/M期阻滞

表1 两组细胞周期分布比例情况

2.4 细胞侵袭转移能力 培养48 h后，对照组和实验组穿过基膜的细胞数量分别为（83.67±4.28）个和（28.33±3.82）个，表明MLN8237对胃癌细胞侵袭能力有较好的抑制作用（P＜0.05）。见图4。细胞培养14 d后，对照组和实验组细胞克隆形成数分别为（417.00±7.25）个和（104.67±5.73）个，实验组细胞克隆形成数明显减少（P＜0.05）。见图5。

图4 MLN8237对胃癌细胞侵袭能力的影响

图5 MLN8237处理对胃癌细胞克隆形成的影响

3 讨论

AURKA的表达、活性水平及定位随着细胞周期的变化呈现一种周期性的动态过程，反映了AURKA参与有丝分裂过程中的一系列重要事件。在G1/S期，它的表达水平很低，但在G2期，AURKA的mRNA水平和蛋白活性水平迅速上调，并在有丝分裂早期达到峰值。随后AURKA水平一直维持在高水平，直到有丝分裂后期，APC/C开始启动AURKA的降解，在G1早期AURKA降解完成[9-10]。近年来研究发现，AURKA在细胞有丝分裂中具有调节中心体成熟和分离、调节细胞有丝分裂等生理功能，同时，这些功能也决定了其在维护正常细胞周期方面有着重要作用[3]。有研究表示，AURKA还可调节细胞从M期向G2期发展，通过干扰RNA的技术干扰AURKA的表达，从而促进细胞在G2/M期的阻滞并促进细胞的凋亡[11]。本研究结果表明，应用MLN8237能促进胃癌细胞出现G2/M期的阻滞，且增殖水平也明显受抑制，其机制可能与AURAK调节细胞有丝分裂有关。

AURKA的异常表达常见于各种肿瘤，目前已知在胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[12]、肺癌[13]和神经胶质瘤[14]等多种人类肿瘤中发现AURKA的异常高表达，而且其扩增和高表达往往还与肿瘤的发生、发展以及预后密切相关。目前已经有将Aurora（极光）激酶作为治疗靶点开发特异性药物治疗肿瘤，第一代药物以VX-680为代表，与Aurora激酶的ATP结合位点结合，阻断其丝氨酸、苏氨酸激酶活性，使其固定在一种非活性构象状态。与pan-Aurora（泛极光）激酶抑制剂不同，MLN8237的第二代抑制剂是ATP竞争性的、可逆的AURKA特异性抑制剂，其对AURKA的敏感性是对AURKB敏感性的200倍。目前，将这些抑制剂用于晚期实体肿瘤和晚期血液肿瘤的治疗的多个I期临床试验已经开展[13]。ARUKA抑制剂在肿瘤治疗中的应用预示着AURKA将成为未来肿瘤治疗的关键靶点。

Wnt信号通路对控制胚胎发育起十分重要的作用，其异常可导致胚胎发育异常和细胞的恶性转化，近年来的研究表明，Wnt信号通路的异常与多种人类肿瘤的发生密切相关[15]。β-catenin是Wnt信号通路的核心成分，参与细胞粘连、生长、增殖等过程，细胞内β-catenin蛋白减少代表Wnt信号通路活性被抑制。本研究结果显示AURKA特异性抑制剂MLN8237的应用可以下调β-catenin的mRNA和蛋白水平，提示MLN8237的应用通过抑制β-catenin蛋白水平抑制胃癌细胞内Wnt信号通路活性，推测胃癌细胞中MLN8237通过影响Wnt信号通路调控胃癌细胞增殖和侵袭过程。

综上所述，MLN8237可以抑制胃癌细胞内AURKA的表达，并可以通过抑制Wnt信号通路从而抑制胃癌细胞内EMT和增殖侵袭。这为胃癌靶向治疗提供了新思路。