α7烟碱型乙酰胆碱受体在电针减轻肢体缺血再灌注兔肺损伤中的作用

宫丽荣，董树安，阚永星，余剑波

肢体缺血再灌注是骨科手术及严重肢体挤压伤常见的病理生理过程，不仅引起肢体局部的损伤，严重时可引起远隔脏器损伤，其中肺脏是最易受累的器官 。研究表明，炎性介质的大量释放引起的炎症反应是肢体缺血再灌注肺损伤主要的发病机制[2-3]。前期研究表明，电针刺可减轻肢体缺血再灌注诱发的肺损伤[4]，但具体作用机制并不明确。α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）是胆碱能抗炎通路的关键受体，参与急性肺损伤的发病过程[5-6]。本文探讨α7nAChR在电针减轻肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤中的作用。[1]

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 本研究经中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会批准。健康清洁级新西兰大白兔40只，雄性，体质量1.9～2.4 kg，3月龄，中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。G6805-1A低频电子脉冲治疗仪（上海华谊医用仪器有限公司）；α-银环蛇毒素（α-BGT，Sigma公司，美国）；戊巴比妥纳（百奥莱博公司）；α7nAChR兔多克隆抗体（Abcam公司，美国）；β-actin一抗、DAB显色试盒（Santa Cruz公司，美国）；山羊抗兔IgG二抗（北京康为世纪生物科技有限公司）；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA试剂盒（R&D公司，美国）。

1.2 分组和模型制作 根据预实验，选取40只新西兰大白兔，采用随机数字表法随机分为假手术组、模型组、电针组和α-BGT组（n=10）。参照文献[7]方法，制作肢体缺血再灌注模型。戊巴比妥纳30 mg/kg 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于特制兔台。右颈内静脉穿刺置管以备输液。于兔双后肢股动脉三角区备皮、消毒、并切开，分离出股静脉、股动脉。以微型动脉夹于近腹股沟韧带处夹闭股动脉3 h形成缺血期，松开无创微动脉夹，再灌注4 h形成再灌注期。假手术组只放置微型动脉夹而不夹闭股动脉。α-BGT组于模型制备前30min腹腔注射α7nAChR拮抗剂α-BGT 1 µg/kg。实验期间持续静脉输注生理盐水1.5 mL/(kg·h)。

1.3 电针刺预处理 参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，采用特殊兔盒暴露针刺部位，选取兔双侧足三里穴（后肢背外侧，胫骨粗隆下部外约0.3 cm处）和肺俞穴（背部，第3胸椎棘突下旁开约1.5 cm处）。消毒，采用直径0.3 mm一次性无菌针灸针，直刺进针约5～7 mm接电针。选用G6805-1A低频电子脉冲治疗仪进行刺激。针刺参数设置：刺激电流l～2 mA，疏密波，频率2/15 Hz，以兔出现轻微肌颤为宜，每次持续30 min，1次/d。电针组及α-BGT组于模型制备前1～4 d及模型制备过程中行电针刺激。

1.4 标本采集 再灌注4 h时，采集颈动脉血样。随后采用颈总动脉放血法处死兔，留取双肺组织。取右肺上叶组织测定W/D比值，取部分左肺组织用10%多聚甲醛固定，取部分左肺组织液氮内速冻处理后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 肺组织W/D比值的测定 取右肺上叶组织100 mg，纱布拭去水渍，置于精细天平上称湿重（W），然后置于80 ℃电热恒温干燥箱烘干72 h。至恒重后称干重（D），计算肺组织W/D比值。

1.6 肺损伤评分 左肺上叶组织置于10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋连续切片厚度4 µm，HE染色，封片，在光学显微镜下观察病理学结果。参照文献[8]方法进行肺损伤评分。

1.7 ELISA法检测肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量 取部分左肺组织，制成组织匀浆，4 ℃下3000 r/min离心10 min，离心半径10 cm。取上清液，按照TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA试剂盒 （R&D公司，美国）说明书进行操作。测定450 nm处的吸光度值，根据标准品的吸光度值分别绘制标准曲线，计算肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6含量。1.8 Western blotting法检测α7nAChR蛋白表达 取-80 ℃冻存肺组织，冻融、剪碎后10000g离心15 min。按照BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取样品10 µg蛋白经凝胶恒压电泳、转膜、封闭1 h，加入一抗（1:1000） 4 ℃孵育过夜。TBST清洗5次，每次5 min，加入山羊抗兔IgG二抗（1:3000）室温孵育1 h后漂洗。TBST漂洗后，于暗室中进行显色和曝光，采用Quantity One图像分析软件进行分析，以目的蛋白与内参β-actin条带积分光密度值的比值反映α7nAChR蛋白表达水平。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，所有数据以均数±标准差（）表示，通过Ryan-Joiner法行正态性检验，采用双侧检验，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。选取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学变化 检测结果显示（图1、表1），灌注4 h时，假手术组兔肺组织未见明显病理改变，模型组、电针组及α-BGT组可见不同程度炎细胞浸润、肺泡或间质水肿、可见出血，电针组水肿、炎细胞浸润和出血均较模型组减轻。模型组、电针组及α-BGT组的肺损伤评分明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的肺损伤评分明显低于模型（P＜0.05），组α-BGT组的肺损伤评分明显高于电针组（P＜0.05）。

2.2 肺组织W/D比值的变化 测定结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及α-BGT组的W/D比值明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的W/D比值明显低于模型（P＜0.05），α-BGT组 的 W/D 比 值 明 显 高 于 电 针 组（P＜0.05）。见表1。

图1 各组兔肺组织病理表现（HE染色×400）

表1 各组兔肺损伤评分及W/D比值的比较（n=10）

2.3 肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6含量变化ELISA结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及α-BGT组的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明显低于模型组（P＜0.05），α-BGT组的TNF-α、IL-1β及IL-6含量明显高于电针组（P＜0.05）。见表 2。

表2 各组兔肺组织TNF-α和IL-1β及IL-6含量的比较（pg/mg）

2.4 α7nAChR蛋白变化 Western blotting结果显示，灌注4 h时，模型组、电针组及α-BGT组的α7nAChR蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.05），电针组的α7nAChR蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05），α-BGT组的α7nAChR蛋白表达明显低于电针组，（P＜0.05）。见图2。

图2 各组α7nAChR蛋白表达的变化

3 讨论

肢体缺血再灌注引起远隔肺损伤发病机制复杂，其中过度的炎症反应是最为重要的机制之一[9]。肢体缺血再灌注诱发炎性反应过程中释放多种促炎细胞因子，其中TNF-a作为肢体缺血再灌注肺损伤时重要的促炎介质之一，是由单核/巨噬细胞和其它促炎细胞激活后释放,其水平升高较其他细胞因子更早。它不仅产生直接的细胞毒性，还能通过中性粒细胞进一步启动炎症级联反应，增加IL-1β、IL-6等其它炎症介质的释放，从而加重肺组织损伤[10-11]。本研究显示，兔肢体缺血3 h 再灌注4 h后，肺组织W/D及肺损伤评分、TNF-α、IL-1β及IL-6浓度升高。说明肢体缺血再灌注继发了肺内炎症反应，导致肺损伤的发生。

胆碱能抗炎通路作为调节免疫系统的一种神经生理机制，主要通过迷走神经和α7nAChR调节炎性细胞因子的分泌和产生发挥抗炎效应，在多器官缺血再灌注损伤及炎症性疾病中发挥良好的机体保护作用[5,12]。α7nAChR是烟碱型胆碱能受体的一员，广泛分布于巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等表面，是胆碱能递质参与调节炎症反应所必需的受体[13]。研究表明，α7nAChR可通过多条途径抑制 TNF-α、IL-1β等炎性因子的合成和释放从而起到抑制炎症反应的作用[14]；特异性激活α7nAChR可通过减少炎性因子的释放减轻肺脏、肾脏以及其它脏器炎症反应导致的损伤[6,12]。

电针刺激具有脏器保护作用，可通过减少炎性介质释放对脏器起免疫调节和保护作用[15]。研究表明，电针刺足三里穴和肺俞穴能够减轻肺损伤，其机制可能与其抗氧化、减少中性粒细胞聚集的作用有关[16-17]。本研究于肢体缺血再灌注模型制备前进行电针刺预处理并参照文献[18]方法给予α7nAChR拮抗剂α-BGT 1 µg/kg。结果表明，电针刺足三里和肺俞穴可上调兔肺组织α7nAChR的表达，并减少炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量，减轻兔肺损伤，而α-BGT可部分拮抗电针刺减少炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的释放以及肺保护作用。综合研究结果，可能提示α7nAChR表达上调减少炎性介质TNF-α、IL-1β及IL-6的释放参与了电针减轻肢体缺血再灌注诱发兔肺损伤的过程，其它可能涉及的机制待研究。