驱动蛋白超家族18A在结直肠癌组织中的表达及意义

李 斌，冯联忠，王春华，鲍 轶，郑 丽，董来荣

结直肠癌的发生、发展和转移是一个多阶段、多因素及多环节的复杂动态变化过程。近年来有研究发现，驱动蛋白的异常表达可影响细胞在有丝分裂过程中遗传物质的分配，导致子代细胞的缺陷，从而引起肿瘤的发生[1]。驱动蛋白超家族18A（kinesin family 18A）由894个氨基酸组成，分子质量约为100 ku(1.0×105)[2]，是驱动蛋白超家族的一个成员，属于微管解聚酶Kip3家族[3]。本研究收集2016年1月—2016年6月嘉兴学院附属第二医院手术治疗的结直肠癌患者35例，从mRNA及蛋白水平检测KIF18A在结直肠癌组织中的表达，探讨KIF18A与结直肠癌临床病理特征和预后的关系，寻求新的结直肠癌分子标记物和治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组共35例，男17例，女18例；年龄42～83岁。取手术切除的新鲜结直肠癌组织及相应癌旁正常组织（距肿瘤边缘大于5 cm），迅速置入专用标本保存液的试管，再置入-80 ℃冰箱保存。

第2组收集2012年1月—2012年7月结直肠癌92例患者的石蜡标本。男46例，女46例。年龄30～86岁，≤60岁30例，＞60岁62例。肿瘤位于结肠48例，直肠44例。肿瘤直径≤4 cm者51例，＞4 cm者41例。有淋巴结转移39例，无淋巴结转移53例。分化程度为高分化5例，中分化67例，低分化20例。TNM分期根据美国癌症联合委员会（AJCC）制定的第7版肿瘤分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期41例，Ⅲ期38例，Ⅳ期2例。

另有2010年1月—2016年1月因结肠损伤等疾病接受手术治疗20例（男17例，女3例；年龄37～69岁）患者的正常结直肠组织（非癌旁组织），制成组织切片，经免疫组化方法进行染色。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 随访 所有结直肠癌病例均经病理学检查证实，均为第一次行结直肠癌手术,术前均未行化疗、放疗及其他抗肿瘤治疗。术后采用门诊和电话方式进行随访，随访至2017年7月6日。术后到患者因肿瘤死亡的时间为总生存时间。

1.3 试 剂 TRIzol（ 美 国 invitrogen 公 司 ）；SYBR-Green荧光染料、定量PCR试剂盒、反转录试剂盒（美国 ABI公司）；一抗，兔抗人KIF18A抗体（美国 Proteintech 公司）；抗兔二抗（武汉博士得生物公司）；实时荧光定量PCR引物由上海生工合成。

1.4 检测方法 实时荧光定量PCR：按照TRIzol说明书对35对新鲜样本提取RNA并检测RNA完整性，然后按逆转录试剂盒说明书要求，逆转录生成cDNA。KIF18A扩增的正向引物5’-GTTCAGCCTATTCCTTGTTGCT-3’，反向引物 5’-GCACACTTTGAGTGGTGGA-3’。

扩增条件：变性阶段（95 ℃， 5 min），扩展定量阶段（95 ℃， 30 s、60 ℃， 60 s），共 40 个循环，绘制溶解曲线。每个样本的检测均重复2次，以GAPDH为内参；CT 表示目的基因的荧光值设定的阈值时的反应循环数。基因相对表达量采用公式2-△△Ct计算，分析目的基因表达量的差异。

免疫组化检测：对组织切片样本进行脱蜡，水化，柠檬酸抗原修复液行热抗原修复，灭活内源性过氧化物酶，加KIF18A抗体过夜，加抗兔二抗工作液，DAB显色，苏木精复染，冲洗，脱水，封片。检测结果由病理医师双盲阅片判定。

1.5 判断标准 以细胞膜/细胞浆呈棕黄色细颗粒状染色为阳性染色。染色面积：未着色为0分，少于25%为1分，25%～75%为2分，大于75%为3分；着色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两者乘积为样本最终评分，样本最终评分0～3分为低表达组，大于3分为高表达组[4]。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。计量资料比较采用配对t检验，采用χ2检验或Fisher精确概率法分析KIF18A与结直肠癌临床病理特征的关系；生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存率的比较采用Log-Rank检验。采用Cox回归模型进行单因素和多因素回归分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF18A mRNA在结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中的表达情况实时定量PCR 检测结果显示，35例结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中的KIF18A mRNA表达量分别为4.056±0.4024和1.253±0.1438，结直肠癌组织中KIF18A mRNA的表达水平显著高于相应癌旁正常组织(P＜0.01)。见图 1。

图1 35对标本中KIF18A mRNA表达差异（结直肠癌组织-癌旁正常组织）

图2 结直肠癌及正常结直肠组织中KIF18A蛋白表达情况（免疫组化染色）

2.2 KIF18A蛋白的表达情况 免疫组化方法检测92例结直肠癌组织及20例结直肠正常组织中KIF18A蛋白的表达，发现其主要表达于细胞质。见图2。KIF18A蛋白在结直肠癌组织中的高表达率为80%（74/92），显著高于结直肠正常组织中的高表达率15%（3/20，χ2= 32.741，P＜0.01）。

2.3 KIF18A蛋白的表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系 分析结直肠癌患者临床病理特征与组织切片中KIF18A蛋白表达情况，结果发现，KIF18A蛋白高表达率与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期相关（均P＜0.05）；浸润至浆膜层、有淋巴结转移和pTNM分期较晚的患者，结直肠癌组织中KIF18A蛋白高表达率较高；而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位及分化程度无关（均P＞0.05）。见表1。

表1 92例结直肠癌患者临床病理特征与KIF18A蛋白表达的关系(n，%)

2.4 KIF18A蛋白表达与结直肠癌患者累计生存率及预后的关系 对92例结直肠癌患者术后生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，行Log-Rank检验发现，KIF18A蛋白高表达组患者的3年生存率为54.1%，明显低于低表达组患者的100%（χ2=15.326.0,P=0.000）。见图3。

单因素Cox回归模型分析提示，肿瘤大小、分化程度、浸润程度、淋巴结转移情况、p TNM分期及KIF18A蛋白表达水平与结直肠癌患者预后相关（P＜0.05）。因肿瘤浸润深度、淋巴结转移与p TNM分期具有相关关系，故将患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期及KIF18A蛋白表达水平纳入多因素Cox回归，结果提示KIF18A蛋白表达水平、pTNM分期为影响本组结直肠癌患者预后的独立危险因素（P=0.019、0.024）。见表 2。

图3 KIF18A蛋白低表达与高表达结直肠癌患者生存曲线的比较

表2 影响本组92例结直肠癌患者总生存率的危险因素分析

3 讨论

结直肠癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤之一。目前我国结直肠癌发病率位居所有恶性肿瘤的第6位，其死亡率为第5位，呈逐年上升趋势[5]。其治疗主要是以手术为主，包括化疗、放疗及靶向治疗等的综合治疗[6]，但整体疗效欠佳[7]。近年来靶向治疗发展迅速，寻找结直肠癌新的、有效的分子标记物和治疗靶点，以提高结直肠癌综合治疗水平。

近年来有研究表明，驱动蛋白超家族是细胞内重要的功能性蛋白，参与细胞器、染色体及RNA结合蛋白的转运，在细胞的有丝分裂过程中起着重要的作用[8]。KIF18A能沿微管向正极运动，并且在微管末端发挥微管解聚酶的作用，从而调节微管长度[9]。动粒微管的长度决定KIF18A的微管解聚能力，KIF18A与姐妹染色体的中板集合及分离密切相关[10-12]。近年来有研究发现，KIF18A蛋白异常表达，将导致细胞有丝分裂过程中姐妹染色体的分离异常，引起细胞的非整倍体发生，从而诱发肿瘤[13]。有研究表明，KIF18A在细胞的有丝分裂周期中发挥重要作用，与细胞周期素B1的表达量周期相似，其表达量在细胞有丝分裂期比分裂间期明显增多[3]。有研究发现，KIF18A在人乳腺癌中呈高表达，其高表达与肿瘤的恶性程度、转移及预后相关[14]。有研究通过对早期肝癌中的KIF18A表达分析，发现其在肝癌组织中高表达水平与患者的不良预后相关[15]。在本研究中，我们首先通过荧光定量PCR方法，发现结直肠癌组织中的KIF18A mRNA表达水平显著高于癌旁组织，说明KIF18A在结直肠癌组织中呈高表达。进一步通过免疫组化染色方法，对92例结直肠癌组织和20例的正常结直肠组织中的KIF18A表达水平进行了检测，分析其与结直肠癌临床病理特征和预后的关系。结果表明，结直肠癌组织中的KIF18A表达水平显著高于正常结直肠组织，并且发现K IF18A 表达与结直肠癌浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期有关，KIF18A在浸润至浆膜层、有淋巴结转移和pTNM分期较晚的结直肠癌组织中的高表达率较高。生存分析结果显示，KIF18A高表达患者3年生存率显著低于低表达者，说明KIF18A表达水平与患者术后生存时间有关。Cox回归分析结果提示KIF18A蛋白表达水平为影响本组结直肠癌患者预后的独立危险因素，进一步提示结直肠癌组织中KIF18A高表达可能不利于患者预后，是潜在的结直肠癌预后指标。

综上所述，KIF18A在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常结直肠组织。KIF18A在结直肠癌组织中的表达水平与结直肠癌浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期有关。结直肠癌组织中KIF18A呈高表达，则可能提示结直肠癌患者预后不良。个人的饮食习惯、有无吸烟等不良的生活方式以及生活环境的污染等因素可能对本研究有所影响，但随着KIF18A基因与结直肠肿瘤关系研究的不断深入，KIF18A有望成为结直肠癌潜在肿瘤标记物和治疗靶点。