基于LED光催化作用的可视化生物传感新方法快速超灵敏检测microRNA-21

(石家庄市第四医院，石家庄 050000)

MiRNA 是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长为20～25 个核苷酸，在生命活动中扮演着至关重要的调控角色[1, 2]。研究表明，几乎所有的肿瘤中均有miRNA的异常表达[3]。MiRNA-21是目前发现的唯一一种在多种实体瘤及非实体瘤中高表达的miRNA，也是第一个在肿瘤病人血清中检测到的miRNA，在人类miRNA功能学研究中具有不可忽视的意义[4]。印迹杂交技术(northern blotting)是miRNA检测最常用的方法，被视为金标准，但操作繁琐、耗时长、灵敏度低、分析检测时需要大量的样品[5, 6]；微阵列芯片方法的明显优势是可实现高通量、多组分同时检测，但制作和检测费较高[7, 8]；RT-PCR是高灵敏度定量检测miRNA的常用实验方法，但容易产生假阳性和假阴性结果[9, 10]，因而发展一种快速、灵敏、高通量的miRNA检测方法具有重要意义。

本研究建立了一种基于TWJ DNA纳米结构及LED光催化作用的可视化生物传感分析方法快速超灵敏检测miRNA-21。具体过程如图 1 所示。将miRNA-21捕获探针固定于亲和素化的96孔板上，捕获探针能够有效的结合靶miRNA-21，随后加入DNA检测探针P1、P2、P3，使其自组装形成TWJ DNA纳米结构[11]。dsDNA-SYBR Green I复合物在LED光照射下可催化TMB产生显色反应[12]，显色信号的强弱与miRNA-21浓度成明显比例关系，可对miRNA-21浓度进行定量。该方法具有较高的灵敏度和良好的重复性，为miRNA-21的检测提供了良好的分析平台。

图1 可视化生物传感分析方法检测miRNA-21示意图

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DNA核酸序列由上海生工生物科学有限公司合成；miRNA-21由宝生物工程(大连)有限公司合成；本研究中使用的核苷酸序列见表1。链酶亲和素、牛血清白蛋白、SYBR Green I、TMB、柠檬酸、磷酸氢二钠、TE缓冲液，PBS缓冲液，2×SSC杂交缓冲液、DEPC水及空白96孔板均购自于上海生工生物科学有限公司合成；光照采用欧普LED灯；显色分析采用PHOMO全自动酶免疫分析仪(郑州安图仪器有限公司)；配制试剂用水全部采用DEPC水，减少miRNA降解。

表1 寡核苷酸序列

1.2 亲和素标记的96-孔板制备

使用pH5.0的200 mM 磷酸氢二钠-100 mM柠檬酸缓冲液稀释链霉亲和素至10.0 μg/mL，得到包被缓冲液。将包被缓冲液滴加到空白板中，每孔100μL，置于温箱中35°C过夜至完全干燥。次日用0.01 M PBS缓冲液冲洗，去除未结合的链霉亲和素。然后100 μL 0.1%牛血清白蛋白溶液滴入板中封闭，放置1小时，封闭未结合位点，随后用0.01 M PBS缓冲液冲洗，室温至完全干燥，干燥的96孔板用封口袋装好于4°C下保存[13]。

1.3 MiRNA-21检测

50 μL 5 μM 生物素标记的捕获探针滴入亲和素包被的酶标板中，室温放置30 min，SSC缓冲液冲洗未结合的捕获探针，随后加入不同浓度的miRNA-21(10 pM-100 nM), 37°C放置30 min，SSC缓冲液冲洗未结合的miRNA-21，加入检测探针P1, P2, P3(50 μL, 5 μM)，37 °C孵育60 min，SSC缓冲液冲洗，30 μL SYBR Green I(1:100)滴入板中，室温放置15min，PBS缓冲液冲洗。最后加入50 μL TMB(200mg/L) 溶液和 20 μL 10% H2O2溶液，放置于LED白光灯光下30min(波长450～465nm)，板呈现蓝色反应，加入50 μL 2M H2SO4终止反应。将96孔板放置于PHOMO自动酶免疫分析仪中测量吸光度(波长450nm和620nm)。

1.4 条件优化-TWJ DNA纳米结构反应时间

为了达到最佳分析效果，本实验对最重要的影响因素TWJ DNA纳米结构反应时间进行了优化。时间优化范围选择30～120min，如图2所示，随着杂交时间的增加，吸光度信号逐渐增高，在60min达到平台，继续增加杂交时间，吸光度值变化不明显，考虑到检测时间及效率的因素，因此选择60min作为TWJ结构最佳反应时间。

图2 TWJ DNA纳米结构反应时间对吸光度的影响

2 结果

2.1 传感器线性分析

为了证实所构建传感器的对于靶物质 miRNA-21 的检测性能。配制不同浓度miRNA-21检测液，利用本研究设计的方法进行检测，检测吸光度随靶物质浓度升高而升高，且与miRNA-21浓度(10 pM-100 nM)的对数值呈现出良好的线性关系。两者的线性关系为Y=0.61 logX-0.246，相关系数为0.997(如图3)，经计算最低检测限约为5.49 pM，充分说明该方法具有较高的灵敏度和良好的线性。因此该方法有望用于miRNA 的定量检测。

图3 吸光度对miRNA-21浓度的校准曲线

2.2 精密度和回收率

选取3个添加水平(100 pM，1 nM，10 nM)，按文中1.3的方法进行检测，每个添加水平平行测定3次。经计算，3种添加浓度的RSD均小于7.3%，回收率在79.8% ～128.8%之间。结果见表2。

表2 不同浓度miRNA精密度和回收率

2.3 方法学比较

为了进一步证实本研究所建立的传感方法的优势，将其它miRNA检测方法的灵敏度及线性范围与其进行比较，表3充分显示了本研究所建立的传感方法具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，在miRNA检测方面具有较大的优势。

表3 本研究提出的传感方法与其它miRNA检测方法的性能比较

3 结论

综上所述，本实验结合了TWJ DNA纳米结构及LED光催化作用的优点，建立了一种新型miRNA检测体系，与传统方法相比较，本方法具有良好的分析性能和较高的灵敏度，回收率高，精确度良好，成本低，无需大型复杂仪器，可在 10 pM～100 nM之间对靶标实现定量检测。结果表明本体系在检测实际样品中具有很大的优势，为今后临床诊断领域提供了新型检测方法。