杂化硅基手性色谱填料的制备及表征

2

(1.江苏汉邦科技有限公司，淮安 223005；2.大连大学环境与化学工程学院，大连116622)

高效液相色谱(HPLC)以其高效、快速的优势广泛应用于医药、环保、化学化工等领域。作为其核心部分，液相色谱柱填料的研究一直备受关注。按照基质材料的不同，高效液相色谱填料可以分为三大类：无机基质填料、有机基质填料和有机-无机杂化基质填料。其中第三种为一类新型硅基材料，是以含有机基团的硅酯为硅源，采用共缩聚法将有机基团直接引入到材料中而得到。与传统的硅基材料相比，基团完全掺入到材料的骨架当中，该种材料结合了无机材料的高效性、优良的机械强度以及有机材料的高化学稳定性和热稳定性等特点，使得这类有机-无机杂化硅基材料被广泛地应用于色谱领域中。

上世纪90年代起，对杂化硅基填料的研究日益活跃，并逐步应用于液相色谱中。1992年，Loy和Shea等人[1]制备了一种苯基桥联聚合半硅氧烷凝胶，将其作为液相色谱填料在正相条件下对芳香烃进行了分离，并且与传统的硅胶做了对比。尽管颗粒的粒径较大(25～38 μm)，形状也不规则，然而杂化硅基填料还是显示出了很好的柱效并表现出不同于传统硅胶的选择性。

1999年，Inagaki[2]等、Stein[3]等和Ozin[4]等分别独立报道了一种骨架中含有机基团的有序介孔材料，是由含有机基团的双硅脂(RO)3-Si-R-Si-(OR)3在模板剂作用下缩聚而成。与传统的有序介孔硅胶相比，此种有机-无机介孔材料不仅可以调节材料的亲水和亲油性能，而且还使得材料具有更加良好的水热稳定性、机械稳定性和化学稳定性。

美国Waters公司开发了一种商品化的有机-无机杂化硅基填料，它用两种硅烷(Si(OR)4和 CH3Si(OR)3)代替传统的一种硅烷(Si(OR)4)制备而成，该材料的平均粒径为5 μm，孔径为12.5 nm，比表面积为179 m2/g。Cheng 等[5]对Waters公司开发的有机-无机杂化色谱填料进行了深入系统的研究，用此类填料在pH=1～11之间分离了强碱性抗抑制剂类药物,取得了较好的分离结果，且在较宽的pH范围内具有很好的稳定性，可通过调节流动相的 pH 值来改善分离效果。

Yu[6]等人通过相同方法制备出了1,4-二甲氧基苯基类型杂化硅基填料，然后进一步修饰C12链，应用于反相色谱中，显示出了良好的耐酸碱性。Peng[7]等人制备的杂化硅基填料，具有高比表面积特性，成果分离了尿嘧啶、苯酚、吡啶、甲苯、乙苯、叔丁基苯，还应用于邻苯二甲酸酯类化合物，均显示了良好的分离效果，显示了良好的耐碱性。。Yue[8]等人通过一步法制备出了C18修饰的杂化硅基填料，应用于尿嘧啶、苯酚、吡啶、1-萘胺、萘等样品的分离，并显示出良好的耐碱性。

前述的杂化硅基填料是合成出来后直试其色谱性能，本研究将制备的氨基杂化介孔硅基填料进行进一步扩孔，通过涂覆的方法在其表面修饰纤维素类衍生物，制备出杂化硅基手性色谱填料，并对其色谱性能进行测试，将杂化硅基填料进一步应用到手性分离中，扩展了其应用范围。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

有机元素分析仪(德国vario MICRO)；比表面积孔径分析仪(美国麦克TriStar 3020)；电感耦合等离子体发射光谱仪(美国赛默飞ICAP 7000)；微型压缩试验机(日本岛津MCT 210)；红外光谱仪(德国布鲁克Alpha)；扫描电子显微镜(美国 FEI Quanta 450FEG)；液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司，NS4201二元分析液相色谱系统)。

微晶纤维素购于Alfa Aesar公司；反式-二苯乙烯氧化物(TSO)、扁桃酸甲酯、黄烷酮、己唑醇，购于美国Sigma公司；十六烷三甲基溴化铵(分析纯)、N,N-二甲基十六胺(分析纯)、氟化铵(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、浓盐酸(37%)均采购于国药试剂有限公司；1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷(97%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(98%)购于百灵威科技有限公司。

1.2 氨基修饰杂化硅基填料的制备及扩孔

1.2.1氨基修饰杂化硅基填料的制备

依次称取2.5 g十六烷基三甲基溴化铵、60 mL去离子水、15 mL甲醇和0.8 g氢氧化钠置于250 mL圆底烧瓶，在25 ℃下，搅拌至使之完全溶解得到透明澄清溶液。在剧烈搅拌下通过滴液漏斗或蠕动泵缓慢滴加2.6 g 1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷和6.25 mL甲醇混合物，再继续缓慢滴加0.7 g氨丙基三乙氧基硅烷和6.25 mL甲醇混合物，在25 ℃下继续搅拌20 h，然后将其转移至聚丙烯塑料瓶中，于95 ℃静置24 h，过滤并用去离子水洗涤干燥。

1.2.2氨基修饰杂化硅基填料的扩孔

称1 g上述氨基杂化硅基填料于聚四氟乙烯水热釜中，并加入0.3 g N,N-二甲基十六胺、30 mg NH4F和30 mL水，搅拌1 h，再80 ℃静置36 h，然后经抽滤、洗涤、干燥得白色粉末粗品。将1g上述扩孔后的白色粉末粗品加入到190 mL酸性乙醇溶液中，50 ℃索氏萃取8 h，过滤并用去离子水、乙醇、四氢呋喃、乙腈、异丙醇洗涤数次，重复上述萃取操作，50 ℃干燥过夜即得到扩孔后的氨基杂化硅基填料。

1.3 杂化硅基手性色谱填料的制备

1.3.1纤维素类衍生物的合成

将纤维素在120 ℃下真空干燥8 h；然后加入适量无水吡啶，抽真空，通氮气，在80 ℃下加热回流24 h；再向其中加入3.5倍摩尔量的3,5-二甲基苯基异氰酸酯，再在100 ℃油浴下反应48 h，冷却至室温，加入甲醇，搅拌后静置沉淀；再以甲醇洗涤抽滤，于90 ℃下真空干燥24 h，即可得到纤维素衍生物。

1.3.2手性色谱填料的涂覆

将上述所得的纤维素衍生物溶于四氢呋喃中，加入一定量的苯甲酸甲酯，超声10 min，得到纤维素衍生物溶液，将纤维素衍生物溶液加到杂化硅基填料中，通过旋转蒸发除去溶剂，60～80℃鼓风干燥16～24h，即可得到杂化硅基手性色谱填料。具体路线如图1所示。

图1 杂化硅基手性色谱填料的合成路线图

2 结果与讨论

2.1 氨基杂化硅基色谱填料的表征

2.1.1显微镜形貌表征

图2是氨基杂化硅基填料的SEM图，可以看出，制备的填料为完整、表面光滑的球形形貌，且粒径较为均一，粒径大小为6～7 μm。

2.1.2比表面积及孔径表征

称取0.2 g扩孔前的氨基杂化硅球，在60 ℃下通氮气6 h，测试其比表面积和孔径。扩孔前的氨基杂化硅基填料的吸脱附曲线及孔径分布曲线如图3所示。从图中可知其属于IUPAC分类中的IV型，H1滞后环，具有介孔结构。用Brunauer-Emmet-Teller(BET)公式计算得其比表面积为980 m2/g，平均孔径为3.0 nm，孔径分布较窄。

图2 氨基杂化硅基填料的扫描电子显微镜图(a).500倍；(b).1000倍；(c).10000倍；(d).15000倍

图3 扩孔前氨基杂化硅球的吸脱附曲线及孔径分布曲线

常规色谱填料的孔径一般要求在10nm左右，以满足小分子样品的分离分析。本研究对制备的氨基杂化硅基填料进行了后续扩孔，考察了诸如扩孔剂含量、组成、扩孔温度、扩孔时间等因素的影响。具体结果如图4，可以看出其吸脱附曲线属于IUPAC分类中的IV型，H1滞后环，具有较大的介孔结构。用BET公式计算得其比表面积在600 m2/g左右，平均孔径在10 nm以上，孔径较大，孔径分布较窄。经后续扩孔得到的氨基杂化硅基填料比表面积和孔径能满足其应用于液相色谱的条件。

图4 后续扩孔后氨基杂化硅球的吸脱附曲线及孔径分布曲线

2.1.3金属离子含量表征

称取0.2 g氨基杂化硅基填料于聚四氟乙烯坩埚中，加4 mL浓硝酸在110 ℃放置1 h，加3 mL氢氟酸在130 ℃放置0.5 h，加2 mL浓高氯酸在170 ℃放置，刚开始有白烟冒出，直至没有白烟冒出且只剩1个小液滴，取出坩埚冷却，转移至容量瓶中并定容。通过ICP测其金属离子含量，结果见表1。从表中可知，所有的金属离子含量均低于50 mg/kg，除Al、Ca、Fe和Na含量相对较高外，其余金属离子含量均低于10mg/kg，可以满足液相色谱填料对金属离子含量的要求。

表1 氨基杂化硅基填料中金属离子含量 mg/kg

注：编号1号和2号分别为滴液漏斗和蠕动泵合成的氨基杂化硅基填料。

2.1.4有机元素分析表征

称取约20 mg样品，用锡箔纸包好，测其C、N、H、S含量。具体结果见表2。从表2可知，制备的氨基杂化硅基填料含有一定量的N，归属于氨丙基中的N；同时C含量较高，这是由于反应原料中含有C-C骨架结构。

表2 氨基杂化硅基填料中CNHS含量

注：编号1号和2号分别为滴液漏斗和蠕动泵合成的氨基杂化硅基填料。

2.1.5红外表征

扩孔后的氨基杂化硅基填料的红外谱图如图5所示，从图中可知2924 cm-1峰为氨丙基的-CH2的C-H特征峰，1616 cm-1峰为氨丙基的N-H特征峰，710 cm-1峰和790 cm-1峰为Si-CH2CH2-Si(BTEE)的Si-C特征峰，1047 cm-1峰和1183 cm-1峰为Si-O-Si特征峰，说明氨基杂化硅基填料为氨基杂化的带乙撑基桥接链的填料。

图5 氨基杂化硅基填料的红外谱图

2.1.6机械性能表征

作为色谱填料，机械强度是其重要参数之一，本研究利用微型压缩试验机对单个微球的机械性能进行了测试， 并与商品化不同孔径大小 (10、20、30 nm)的硅胶进行了对比，具体如图6所示。可以看出，氨基杂化硅基填料具有较大的Cs值(填料破碎时的压强值)，说明杂化硅基填料在色谱柱装填过程中较难以破碎，机械强度较好。

图6 杂化硅基填料与不同孔径商品化填料机械强度对比图(a).氨基杂化硅基填料；(b).商品化硅胶(孔径10 nm)；(c).商品化硅胶(孔径20 nm)；(d).商品化硅胶(孔径30 nm)

2.2 杂化硅基手性色谱填料色谱性能测试

2.2.1涂覆量的影响

利用TSO对所制备的不同涂覆量的手性色谱填料进行了色谱性能表征，从图7中可以看出，10%涂覆量的手性填料并不能实现了TSO样品的R、S构型的基线分离，15%涂覆量的手性填料实现了TSO样品的R、S构型的的基线分离，Rs>1.5，且分离结果较好。

图7 不同涂覆量的杂化硅基手性色谱填料分离TSO的HPLC谱图流动相：正己烷/异丙醇(90/10)，流速1mL/min。

2.2.2色谱性能测试

首先，对纤维素-3,5二甲基苯基氨基甲酸酯修饰杂化硅基手性色谱填料进行了重现性测试。以TSO为测试对象，连续进样3次，R、S两种构型的RSD值为1.2%和1.9%，图8为重现性谱图，表明TSO样品在制备的手性填料上具有良好的重现性。本研究还对纤维素-3,5二甲基苯基氨基甲酸酯修饰杂化硅基手性色谱填料进行了稳定性测试，用正己烷/异丙醇(90/10)流动相冲洗色谱柱96小时，发现其保留时间没有明显变化(如图9所示)，显示出良好的稳定性。

图8 杂化硅基手性色谱填料分离TSO的HPLC重现性谱图

图9 杂化硅基手性色谱填料稳定性测试

图10 杂化硅基手性色谱填料分离4种手性样品HPLC谱图

然后对填料进行了应用研究，利用纤维素-3,5二甲基苯基氨基甲酸酯修饰杂化硅基手性色谱填料对TSO、扁桃酸甲酯、黄烷酮、己唑醇4种手性样品进行了分离，由图10可见，各个手性样品均实现了较好的分离，扩展了此种新型液相色谱填料的应用范围。

3 结论

首先通过溶胶凝胶法成功制备出了氨基杂化硅基填料，并对其物理参数进行了表征，各项参数都满足了液相色谱填料要求。然后在其表面涂覆纤维素三(3, 5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，制备出杂化硅基手性色谱色谱填料，测试了其良好的HPLC重现性，并对TSO、扁桃酸甲酯、黄烷酮、己唑醇等手性样品进行了HPLC手性拆分，取得了良好的分离结果，进一步扩展了杂化硅基填料在色谱领域中的应用范围。