腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对逆转卵巢癌顺铂耐药的效果

田丽娜，徐福强，姬力群，刘小平，单 育，杨菲菲，陈 静，瞿全新

卵巢癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤，化疗是治疗卵巢癌的重要方法，但由于肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性，因而影响化疗效果，导致卵巢癌的总体五年生存率始终徘徊在30%[1]。化疗耐药的产生，尤其是铂类药物的耐药是困扰卵巢癌治疗的重要难题之一。核苷酸切除修复(NER)是顺铂耐药的重要机制，而ERCC1基因是NER途径的重要因素，在顺铂耐药机制中发挥重要作用[2,3]。本实验通过重组腺病毒方法干扰ERCC1的表达，初步探讨其在体外逆转卵巢癌细胞对顺铂耐药的效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 人类卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP，中高分化，购于北京市肿瘤医院药物研究所。

1.1.2 相关试剂 注射用顺铂(冻干型)：齐鲁制药厂(批号为H20023461)。重组腺病毒Ad-hTERT-ERCCl-siRNA及只包含ERCC1启动子的空载体腺病毒：Ad-hTERT由本研究小组前期合成[4]。RPMI-1640培养液、小牛血清与前期实验相同[5]。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养等方法 细胞培养、药物配置、台盼蓝排斥试验、MTT法测定SKOV3/DDP细胞顺铂IC50值、MTT法测定腺病毒对SKOV3/DDP细胞的影响、MTT法测定腺病毒对SKOV3细胞顺铂IC50值的影响与前期实验相同[5]。

1.2.2 细胞凋亡的形态学观察 取对数生长期SKOV3/DDP细胞，以1×105/ml浓度每孔500 μl接种于24孔板内，培养24 h后，分别用0、80 MOI的重组腺病毒感染细胞，分为2组。培养4 h后，其中一组细胞加入顺铂，调整终浓度为10 μg/ml，培养24 h后，按照Hoechst试剂盒方法固定染色[5]，荧光显微镜下观察并拍照。实验重复3遍。

1.2.3 流式细胞技术测定顺铂及腺病毒作用的细胞周期与凋亡 将生长良好的SKOV3/DDP细胞，以1.6×105/ml浓度6 ml传代至新培养瓶中，共11瓶，培养24 h后，加入治疗药物，分组方法为：(1)重组腺病毒组，添加重组腺病毒MOI 0、MOI 1、MOI 10、MOI 50、MOI 80；(2)重组腺病毒联合顺铂组，在(1)的基础上添加终浓度为10 μg/ml的顺铂；(3)空载体腺病毒联合顺铂组，在顺铂终浓度为10 μg/ml的基础上添加空载体病毒：MOI 50。以上各组细胞培养24 h后终止，收集细胞处理后，按流式细胞试剂盒操作方法，测定细胞凋亡和周期分布[5]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，生长曲线图采用折线图方法绘制，回归方程及IC50采用回归分析计算，均数比较采用单因素方差分析。顺铂浓度与抑制率关系及腺病毒浓度与细胞对顺铂的敏感性关系采用相关分析。

2 结 果

2.1 SKOV3/DDP细胞生长情况 SKOV3/DDP细胞生长良好，对数生长期细胞生长曲线及形态见图1。

图1 SKOV3/DDP细胞生长曲线及形态

A.对数生长期细胞生长曲线;B.SKOV3/DDP细胞对数生长期形态(×400)

2.2 顺铂和腺病毒对SKOV3/DDP细胞的影响 SKOV3/DDP细胞给予顺铂处理后，随着顺铂浓度的增加，SKOV3/DDP细胞的存活数量进行性下降，细胞抑制率逐渐升高，顺铂浓度与SKOV3/DDP细胞抑制率呈线性正相关(图2A)，相关系数r=0.9862 (P<0.05)，顺铂IC50为(13.93±0.37)μg/ml，耐药指数为1.79。而SKOV3/DDP细胞给予不同腺病毒处理后，空载体腺病毒组中SKOV3/DDP细胞的存活数量无明显改变。而重组腺病毒组中，随着MOI的逐渐增加，SKOV3/DDP细胞的存活数量逐渐减少，细胞抑制率逐渐升高(图2B)，两组间具有统计学差异(P<0.05)。

图2 顺铂和腺病毒对SKOV3/DDP细胞的影响

A.顺铂对SKOV3/DDP细胞的抑制率;B.不同腺病毒对SKOV3/DDP细胞的抑制率

2.3 腺病毒对SKOV3/DDP细胞顺铂敏感性的影响 空载体腺病毒组中SKOV3/DDP细胞IC50无明显变化(图3A)，对顺铂的敏感性无明显改变(图3B)。重组腺病毒组中SKOV3/DDP细胞IC50进行性下降，并且呈浓度相关性(r=0.9786，P<0.05)，两组间结果具有统计学差异(图3A)，MOI 80时耐药指数为1.19。SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性随病毒浓度的增加而增加，分别增加了11.1%(t=9.757，P<0.05)、16.7%(t=15.07，P<0.05)、26.4%(t=22.183，P<0.05)、33.5%(t=24.921，P<0.05) ，并呈浓度相关性(r=0.9716，P<0.05) (图3B)。

图3 腺病毒对SKOV3/DDP细胞顺铂敏感性的影响

A.感染病毒后SKOV3/DDP细胞顺铂的IC50变化；B.感染病毒后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化

2.4 细胞凋亡的形态学观察 经Hoechst染色后，荧光显微镜下观察，正常细胞呈蓝色。细胞发生凋亡时，染色质固缩，胞核致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色略发白。正常SKOV3/DDP仅偶见凋亡细胞核(图4A)，顺铂组可见一些细胞凋亡现象(图4B)，重组腺病毒处理组SKOV3/DDP细胞凋亡较正常组增多(图4C)，顺铂联合腺病毒干预后，SKOV3/DDP细胞活力下降，细胞形态皱缩，边缘不整，并出现凋亡小体，此为细胞凋亡的特征，凋亡细胞明显增多(图4D)。

图4 SKOV3/DDP细胞凋亡的形态学观察

A.正常SKOV3/DDP细胞; B.DDP 10μg/ml; C.重组腺病毒MOI 80; D.DDP 10μg/ml+重组腺病毒MOI 80

2.5 细胞凋亡和细胞周期测定 本实验测得SKOV3/DDP细胞G1、S和G2/M期细胞分别为56.56%、32.62%和10.82%，凋亡率为28.13%(图5 A-D)。

SKOV3/DDP细胞不同MOI的重组腺病毒感染后，细胞周期左移，G1期比例稍有减少(图5A)，S期比例有所增加(图5B)，细胞凋亡率有所增高 (图5D)，无统计学差异(P>0.05)。

与SKOV3/DDP细胞相比，单纯顺铂作用的SKOV3/DDP细胞，G1期细胞比例减少 (图5A), S期细胞比例增高 (图5B)，G2/M期比例有所增加 (图5C)，凋亡率增高(图5，D)，结果具有统计学差异(P<0.05)。

重组腺病毒联合顺铂作用下，SKOV3/DDP细胞的Gl期比例增加 (图5A)，S期比例一定程度增加 (图5B)，G2/M期比例明显减少 (图5C)，细胞凋亡率进一步增加 (图5D)，与单纯顺铂作用组相比具有统计学差异(P<0.05)。而空载体病毒联合顺铂作用下SKOV3/DDP细胞，与单独顺铂治疗组相比，细胞周期分布相近，细胞凋亡率无明显改变(图5E)，结果无统计学差异(P>0.05)。

图5 流式细胞技术测定顺铂及腺病毒作用的细胞周期与凋亡结果

A.不同处理后SKOV3/DDP细胞G1期的比率;B.不同处理后SKOV3/DDP细胞S期的比率; C.不同处理后SKOV3/DDP细胞G2/M期的比率; D.不同处理后SKOV3/DDP细胞凋亡率;E.不同处理后SKOV3/DDP细胞周期比率及凋亡率

3 讨 论

卵巢癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤，化疗是治疗卵巢癌的重要方法，但由于肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性，目前已知，NER是顺铂耐药的重要机制之一，而ERCC1是NER途径的重要因素，在顺铂耐药中起着重要作用[6-8]。唐琳等[9]用组织芯片仪制备组织芯片并结合免疫组化方法技术，检测56例卵巢上皮性癌患者组织中ERCC1蛋白的表达情况，并以38例正常卵巢组织作为对照，分析其与顺铂化疗耐药的关系，结果证实上皮性卵巢癌ERCC1表达与顺铂化疗耐药相关。随着分子生物学技术的改进，人类基因组测序工作完成，部分基因治疗已进入临床试验阶段，而且已在多种基因治疗的基础性研究中显露锋芒。例如，陈国强等[10]实验研究证实，RCC1的表达水平与复发性卵巢上皮癌患者耐药性产生相关。本实验采用腺病毒感染人卵巢癌SKOV3/DDP细胞株的方法，干扰ERCC1的表达，观察其体外逆转卵巢癌对顺铂耐药的效果。

采用重组腺病毒载体感染卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，MTT实验结果表明，载体腺病毒对细胞生长无明显抑制作用，而重组腺病毒具有抑制细胞生长的作用，具有剂量依赖性，SKOV3/DDP在感染了重组腺病毒后，其对顺铂的IC50逐渐下降，顺铂的敏感性逐渐增加，耐药指数由1.79降低为1.19，接近敏感株水平[5]，组腺病毒干扰ERCC1表达后对SKOV3/DDP具有逆转顺铂耐药作用，并且呈剂量依赖性。通过观察细胞形态变化发现，重组腺病毒载体感染的细胞变圆，体积稍大，细胞间的连接较疏松，表明抑制ERCCl基因表达，使耐药肿瘤细胞生长受到一定的抑制，高于重组腺病毒对敏感株的抑制作用，这可能与端粒酶的活性与卵巢癌细胞株的耐药性有关[11]。

流式细胞检测发现正常生长状态下SKOV3/DDP细胞多数处于G1期，S期次之，G2/M期最少，细胞增生活跃程度弱于敏感株，与耐药株倍增时间大于敏感株一致[5]。重组腺病毒对耐药株SKOV3/DDP细胞具有较弱S期阻滞和诱导凋亡的作用。顺铂对耐药株SKOV3/DDP细胞的S期阻滞作用及诱导细胞凋亡作用弱于敏感株SKOV3细胞，由此导致SKOV3/DDP对顺铂耐药。而重组腺病毒联合顺铂作用下，SKOV3/DDP细胞周期阻滞于S期比例增加，细胞凋亡率增高，表明重组腺病毒通过干扰ERCCl基因表达，增加顺铂对耐药株的S期的阻滞、抑制细胞DNA复制、促进细胞凋亡。重组腺病毒干扰ERCCl基因表达，逆转顺铂耐药可能与调节肿瘤细胞周期分布及诱导肿瘤细胞凋亡有关。

综上所述，重组腺病毒可以通过抑制卵巢癌细胞ERCC1基因的表达、调节肿瘤细胞周期、诱导卵巢癌细胞凋亡等途径部分逆转卵巢癌顺铂耐药。本研究将RNA干扰技术与基因重组及基因载体技术联合应用，为基因治疗逆转卵巢癌顺铂化疗耐药提供了新的思路，为以ERCC1基因为靶基因治疗卵巢癌、逆转卵巢癌顺铂耐药提供了可靠的实验依据，但还是需要进行深入的动物实验，来确证以ERCC1为靶基因的RNA干扰方法治疗卵巢癌、逆转卵巢癌顺铂耐药的有效性。