DCC和MKK4基因在结直肠癌组织中的表达及临床意义*

张 慧,陈景志,陈建立,张 琪,张国志

华北理工大学附属医院普外科(唐山 063000)

结直肠癌是临床上常见的消化道肿瘤，据统计，结直肠癌的发病率和病死率分别居全球癌症发病率和病死率的第3位和第2位，2018年全球新增结直肠癌患者约185万例，死亡约88万例[1]。结直肠癌的发病率与国家经济发展水平呈正相关，欠发达国家结直肠癌的发病率仅为发达国家的1/3左右。相对于发病率来说，结直肠癌的病死率在全球各地区差异较小[2]。发达国家结直肠癌病死率下降主要原因是有效且规范的肿瘤治疗管理策略以及针对结直肠癌开展大规模的筛查及早诊早治项目[3]。目前结直肠癌的发病原因尚不明确，有研究表明，超重和肥胖[4]、久坐[4-5]、红肉和加工肉制品的摄入[6]可增加患结直肠癌的风险，体育锻炼[4-5]、谷类等植物性食物[7]、鱼类[8]、维生素D[9-10]、钙[11]、叶酸[12]的摄入会降低患结直肠癌的风险。由于结直肠癌早期缺乏典型的症状和体征，且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术，大部分患者就诊时已是中晚期，失去了最佳治疗时机，因此临床上应进行早期诊断，积极采取治疗措施[13]。结直肠癌缺失基因(Delected in colorectal carcinoma ,DCC)被认为是最大的抑癌基因之一，参与结直肠癌的演变及转移。丝裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，可同时磷酸化并激活JNK及P38信号转导通路，导致细胞增殖、分化及凋亡等。本研究采用RT-PCR、Western-blot、免疫组织化学法，检测60例结直肠癌组织及对应癌旁组织中DCC、MKK4的表达情况，并分析其表达与临床病理因素的关系，为结直肠癌的诊断提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。

资料与方法

1 一般资料 收集60例华北理工大学附属医院2017年9月至2018年8月手术切除的结直肠癌组织标本及其对应的癌旁组织标本，其中男38例，女22例；≤60岁患者36例，>60岁患者24例，肿瘤位于结肠者32例，位于直肠者28例；隆起型25例，溃疡型30例，浸润型5例；高分化者12例，中分化者40例，低分化者8例；伴有淋巴转移19例，无淋巴转移41例；伴有远处转移10例，无远处转移50例；浸润深度：T14例、T214例、T336例、T46例。所有患者术前均未接受化学药物治疗及放射治疗。所有手术标本于术后30 min内置于液氮中，-80℃冰箱储存备用，癌旁组织取距离肿瘤边缘5 cm以上的组织。

2 主要试剂 PCR试剂：DCC、MKK4引物(美国Invitrogen公司)，TRIpure Reagent(上海康朗生物公司)，逆转录试剂盒(美国Gene Copoeia公司)，Beyo Fast SYBR Green Qpcr Mix试剂盒(广州碧云天生物技术有限公司)。Western-blot试剂：anti-DCC，稀释度1∶2000、anti-MKK4，稀释度1∶1000、anti-GAPDH，稀释度1∶1000(美国Affinity公司)。免疫组织化学试剂：DCC兔源的单克隆抗体，稀释度1∶250、MKK4兔源的单克隆抗体，稀释度1∶200(武汉博士德生物公司)，DAB染色试剂盒(武汉博士德生物公司)，PBS(上海士锋生物公司)。

3 研究方法 ①RT-PCR：组织总RNA提取，检测RNA浓度及纯度(A260/A280=1.8～2.0最佳)，RNA逆转录为cDNA，PCR扩增(扩增条件95℃预变性5 min、95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s、40个循环。引物设计：DCC：Forward 5'-CGGAGCAGGAAGAAGTCAGT-3'，Reverse5'-GCTTTTCCAGCCAACCCAAG-3';MKK4：Forward 5'-TCGGCTCTTCACTCCCAACA-3'，Reverse 5'-TCAACTTCAGTGCTTTGCGTT -3';GAPDH：Forward 5' -ATGATGATATCGCCGCGCTC-3'，Reverse 5' -GTACATGGCTGGGGTGTTGA-3'。②Western-blot：提取组织蛋白，蛋白充分变性后测浓度，Western-blot检测不同组织中DCC、MKK4的表达情况，内参选用GAPDH。③免疫组化：包埋、切片，脱蜡、染色、脱水、透明、封固(阴性对照以PBS代替第一抗体)。

4 结果判读 ①RT-PCR:DCC、MKK4基因的相对表达量采用2-△△CT法进行定量分析。②Western-blot：应用软件Image J分析条带灰度值。DCC蛋白相对表达量=DCC灰度值/GAPDH灰度值,MKK4蛋白相对表达量=MKK4灰度值/GAPDH灰度值。③免疫组织化学：DCC、MKK4蛋白表达主要位于细胞浆，其中出现淡黄色至棕褐色颗粒且染色强度高于背景特异性着色者为阳性细胞。光镜下综合考虑染色强度和阳性染色细胞数百分率记分进行结果判断[2]。按染色强度记分:0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。按阳性染色细胞百分率记分,1分为11%～50%,2分为51%～75%,3分为>75%,两项得分相乘结果>3为阳性(+)病例,≤3为阴性(-)病例。

5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进计分析。独立样本比较采用t检验，率的比较采用卡方检验或确切概率法，所有结果均以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 RT-PCR法检测结直肠癌及癌旁组织中DCC、MKK4基因表达水平 结直肠癌组织中DCCmRNA、MKK4mRNA表达水平均低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 DCCmRNA、MKK4mRNA在结直肠癌及对应癌旁组织中的表达水平

2 Western-blot法检测结直肠癌组织中DCC、MKK4蛋白表达水平 结直肠癌组织中DCC、MKK4蛋白表达均明显低于癌旁组织(图1)，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图1 结直肠癌及癌旁组织中DCC、MKK4蛋白的表达情况

表2 DCC、MKK4蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达水平(灰度值)

3 免疫组织化学法检测结直肠癌及癌旁组织中DCC、MKK4蛋白表达 DCC、MKK4蛋白表达主要定位于细胞浆中，少数见于细胞核(图2)。结直肠癌组织中DCC蛋白表达阳性率为20.0%,对应癌旁组织中DCC蛋白表达阳性率96.7%,差异具有统计学意义(P<0.05);结直肠癌组织中MKK4蛋白表达阳性率为28.3%,对应癌旁组织中MKK4蛋白表达阳性率95.0%,差异具有统计学意义(P<0.05);见表3。

表3 直肠癌及癌旁组织中DCC、MKK4蛋白表达比较[例(%)]

图2 DCC、MKK4蛋白在结直肠癌及癌旁组织的表达(Elivison法，×200)

4 结直肠癌组织中DCC、MKK4蛋白表达与临床病理参数的关系 DCC、MKK4蛋白表达水平均与肿瘤分化程度、淋巴转移、远处转移有显著相关性(P<0.05)，与性别、年龄、肿瘤部位、大体形态、浸润深度等无统计学相关性(P>0.05)，见表4。

表4 结直肠癌组织中DCC、MKK4蛋白表达与临床病理参数关系

讨 论

1 DCC与结直肠癌的关系 结直肠癌缺失基因(DCC),是一个重要的抑癌基因，于1990年被Fearon等[14]确认并命名，定位于人染色体18q21.3,是细胞生长、分化及生存的重要调节者，其表达产物p192是一种细胞黏附因子，在细胞信号传导中发挥重要作用，可使细胞间具有较强的黏着性，限制细胞的转移能力，因此DCC基因的缺失会减弱细胞之间的相互作用，造成细胞的恶性转移。研究发现DCC基因在胃癌[15]、卵巢癌[16]、子宫颈癌[17]、子宫内膜癌[18]中表达下调。本实验结果表明：DCC基因在结直肠癌组织中表达水平明显降低，且其表达水平与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、远处转移有关，说明DCC为结直肠癌抑制基因，DCC基因表达缺失与结直肠癌的发生、发展、转移呈正相关，所以DCC基因可能成为结直肠癌患者早期诊断、治疗及判断预后的一个生物学标志。

2 MKK4与结直肠癌的关系 丝裂原激活蛋白激酶4(MKK4)定位于人染色体17p11.2，可以编码399个氨基酸残基的蛋白质，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。MKK4能通过激活核因子κB抑制细胞凋亡，同时磷酸化并激活JNK及p38信号转导通路，导致细胞增殖、分化及凋亡等，其突变致下游底物磷酸化，从而放大MAPK信号转导。研究发现MKK4基因在肝癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]、鼻咽癌[22]中表达下调。本实验结果表明：MKK4基因在结直肠癌组织中表达水平明显降低，且其表达水平与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、远处转移相关，提示MKK4为结直肠癌抑制基因，与结直肠癌的发生、发展、转移相关，所以检测MKK4基因的表达对判断结直肠癌的转移及预测患者预后具有重要意义。