基于超声成像技术的冷鲜与解冻牛肉鉴别方法

孙宗保 王天真 邹小波 闫晓静 梁黎明 刘小裕

(江苏大学食品与生物工程学院， 镇江 212013)

0 引言

牛肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点[1]。随着社会经济的发展，我国牛肉的消费需求量逐年增加，同时人们对牛肉的品质要求也不断提高[2]。我国肉牛行业起步较晚、起点较低，高档牛肉消费需求主要以进口为主[3]。冷鲜牛肉和冷冻牛肉是现阶段我国主要的牛肉进口形式。冷冻牛肉在冷冻过程中由于冰晶生长，细胞和组织结构遭到机械挤压和破坏[4]，蛋白质发生变性，肉的胶体性质被破坏；在解冻过程中，肉内汁液大量流失，造成肉品食用品质下降[5]。而冷鲜牛肉从加工到销售始终处于冷链控制下，酶的活性和大多数微生物的生长繁殖被抑制，并且冷鲜牛肉经历了较为充分的成熟过程，肉的嫩度增加，肉质得到改善，滋味鲜美。通常情况下，冷鲜牛肉比同类冷冻牛肉货架期短，价格也高。近年来，有不法商贩将冷冻牛肉解冻后充当冷鲜牛肉贩卖，从中获取非法利益，消费者从感官上难以辨别。因此有必要对冷鲜与解冻牛肉进行有效的区分。目前鉴别冷鲜和解冻肉的方法有酶法、DNA法、光谱法、生物成像法和感官评价法等[6]，这些方法存在有损、耗时或片面不直观的缺点，所以有必要研究一种全面直观、无损快速的检测方法。

超声波是指超出人耳听力范围的机械波(频率20 kHz以上)[7]，根据能量水平可分为高能量超声波和低能量超声波。高能量超声波常用于清洗[8]和强化辅助[9]，低能量超声波常用于检测[10]和诊断[11]。当超声波传经两种声阻抗不同的相邻介质的界面时，会发生反射和折射。超声成像设备利用传感器收集处理超声波在待测物质中传播产生的反射回波，在计算机上形成图像，通过图像可对待测物质的内部结构作出评价。超声成像技术作为一项准确、快速的无损检测技术，目前广泛运用于医疗诊断[11-12]、工业检测[13-14]等领域。文献[15]通过采集分析超声图像，利用超声成像技术成功鉴别大西洋鲑早期性别和发育期，为超声成像技术在鱼类养殖中的应用提供参考。而超声成像技术在食品检测领域的应用报道较少。文献[16]通过插值法等方法处理优化因衍射和折射效应发生扭曲的超声图像，成功检出干酪和鸡肉中异物。解冻牛肉经冷冻又解冻的过程，质构会发生变化[17]，因此可以通过牛肉的质构信息对牛肉品质作出评价。文献[18]分别测定了冷鲜和解冻牛肉的质构参数和新鲜度指标，建立了牛肉质构参数与新鲜度之间的关系。超声成像技术可以获得待测物体内部结构声学特性的信息[19]，不同质构特性的牛肉对超声波反射强度不同，故可以通过对冷鲜与解冻牛肉超声图像的采集处理，进行冷鲜和解冻牛肉质构分析和鉴别。

本文利用超声成像技术采集冷鲜与解冻牛肉的超声图像，结合质构参数、微观结构和部分理化指标分析图像差异的成因，用灰度共生矩阵法提取图像的纹理特征变量，建立线性判别分析和支持向量机模型，对冷鲜与解冻牛肉进行判别，以期为超声成像技术在冷鲜与解冻牛肉判别方面的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品准备

试验所用样本产地均为澳大利亚，活牛在澳大利亚宰杀分割包装后空运至国内，再通过冷藏车运送到镇江麦德龙超市，全程冷链运输。从镇江麦德龙超市购得12块真空包装的牛腱子肉，每块牛腱子肉(800 g左右)切割出10个3 cm×3 cm×1 cm的肉块，共计120个样品。其中60个样品作为冷鲜肉冷藏7 d后进行试验，另外60个样品经真空包装机独立真空包装后置于-18℃冰柜中冷冻7 d后取出，在4℃下解冻2 d后进行试验。样品一半用于理化试验，另一半用于质构测定和超声图像采集。为了使冷鲜和解冻牛肉更具有对比性，切割出的相邻的两块牛肉其中一块作为冷鲜肉，另一块作为解冻肉进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1质构测定

采用TA-XT2i型质构仪(英国 SMS 公司)对样品进行质构测试，采用P/50型探头，探头垂直肌纤维方向进行测定。测试条件：环境温度20～25℃，测前速率5 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率5 mm/s，压缩比35%，测定间隔时间5 s。质构测定结果用TPA-macro程序分析。

1.2.2微观结构观察

分别从冷鲜与解冻牛肉上取0.3 cm×0.3 cm×0.6 cm肉样，放入4%多聚甲醛中4℃固定48 h，酒精脱水，石蜡包埋，切片厚约为5 μm，HE(苏木精-伊红染色法)常规染色，最后封片。使用DM6000B型显微镜进行切片观察。

1.2.3色差和蒸煮损失率测定

采用Hunterlab型分光测色仪，测定样品的L*、a*和b*值(明度、红度和黄度)。测试前先用标准白板和黑卡校正仪器。每个牛肉样品在不同肌肉位置测定3次，取平均值。

取一定量的肉样，用分析天平准确称量，记为m1，装入蒸煮袋中密封，放入80℃的水浴锅中加热20 min后取出，冷却后用吸水纸吸干肉块表面水分，再次称量，记为m2。

蒸煮损失率计算公式为

式中W——蒸煮损失率

m1——蒸煮前肉样质量

m2——蒸煮后肉样质量

1.2.4超声图像采集

通过实验室自主研发的超声显微成像系统采集样品的超声图像，系统示意图如图1所示。系统部件主要包括UTEX 320型超声波激发/接收器(加拿大UTEX Scientific Instruments公司)，直径10 mm、焦距25.4 mm的20 MHz点聚焦型超声波换能器(日本Olympus Corporation公司)，高速A/D数据采集卡(美国Agilent Technologies公司)，三轴精密直线电机扫描机构(珠海创峰精工机械有限公司)，计算机，样品槽等。设定不同超声图像采集参数进行多次试验并采用拉普拉斯梯度法评价不同参数下图像清晰度，由此确定了牛肉超声图像采集的最佳参数。最佳参数为：脉冲电压250 V；脉冲宽度25 ns；脉冲频率800 Hz；增益55 dB；分辨率0.1 mm；扫描速度5 mm/s。所有样品在相同的参数和环境下进行超声图像采集。

图1 超声显微成像系统Fig.1 Ultrasonic imaging system1.超声波激发/接收器 2.数据采集卡 3.计算机 4.运动控制卡 5.主控电路 6.三轴移动平台 7.换能器 8.试样 9.水平台

1.2.5数据处理

纹理分析是超声图像分析的重要手段。纹理信息可以反映超声回波信号分布情况，从而评价牛肉内部结构。灰度共生矩阵反映了图像灰度级空间分布二阶纹理信息。采用灰度共生矩阵法提取超声图像的纹理特征值，从0°、45°、90°和135°共4个方向计算灰度共生矩阵，提取各方向下的角二阶矩(Angular second moment，ASM)、对比度(Contrast，CON)、相关性系数(Corrlation，COR)和逆差矩(Homogeneity，HOM)，并计算图像的熵(Entropy，ENT)、各向异性系数(Anisotropy)、平均灰度(Average，AVG)和方差(Variance，VAR)，得到共计20个纹理特征变量。先通过主成分分析法(Principal component analysis，PCA)对所得纹理特征变量进行降维，再分别建立线性判别分析(Linear discriminant analysis，LDA)模型和支持向量机(Support vector machine，SVM)模型，并比较识别效果。采用SPSS 23.0软件进行数据方差分析，采用Matlab 7.0软件提取超声图像纹理和建立判别模型。

2 结果与分析

2.1 质构测定结果

质地多面剖析法(Texture profile analysis，TPA)是质构仪利用探头模拟人口腔的咀嚼运动，对样品进行两次压缩，用软件输出质构参数的方法[20]。通过表1可以看出，测得的冷鲜和解冻牛肉各项质构参数有极显著差异(P<0.01)。硬度是使食品达到一定形变所需要的力，反映了食品保持外形结构的内部结合力。解冻牛肉的硬度小于冷鲜牛肉的硬度，这是由于冻藏过程中肌细胞间自由水形成冰晶后，肌细胞内的结合水以之为晶核使冰晶生长，而在解冻时部分冰晶解冻后的水无法回到肌细胞内，使得肉持水性变差，可溶性物质减少，使得肉块硬度减小。解冻牛肉的内聚性小于冷鲜牛肉，说明解冻牛肉结构的内部键力小，口感较差。牛肉中水化层与蛋白质形成的网状结构具有抵抗外力的能力，表现为肉的回复性[18]。解冻牛肉比冷鲜牛肉回复性差，可能是由解冻肉系水力下降，蛋白质变性所导致。质构结果综合表明，经冷冻解冻的牛肉内部结构受损严重，汁液流失严重，原本复杂有序的结构趋向均匀。

表1 冷鲜与解冻牛肉质构测定结果Tab.1 Results of texture indexes of fresh and frozen-thawed beef

2.2 微观结构

冷鲜牛肉与解冻牛肉的肌原纤维微观结构如图2所示，图2a和图2b分别是在光学显微镜下看到的冷鲜与解冻牛肉肌原纤维的石蜡切片图。从图中可以看出，冷鲜牛肉肌纤维结构完整，肌纤维断面呈圆形或多边形，细胞周边有较多的细胞核。肌纤维之间有一定间隙，这是因为进口牛肉经过一定时间的冷鲜储存品质略有下降。解冻牛肉肌肉组织的完整性被破坏，肌内膜和肌束膜破裂，肌纤维边界模糊，肌原纤维蛋白内部的水迁移到膜外。由于肌纤维在牛肉冷冻时受到冰晶体挤压出现裂口，解冻后细胞液流出，与组织液混合。

图2 冷鲜与解冻牛肉微观结构图像Fig.2 Microstructure diagrams of fresh and frozen-thawed beef

2.3 色差及蒸煮损失率测定结果

除了从质构指标和微观结构上可以看出肉内组织结构的变化，肉样的一些理化指标也可以侧面反映组织结构变化情况。结合实际条件，选取L*、a*、b*和蒸煮损失率4个理化指标来观察分析。

肉色是评价肉类品质的一个重要指标，它很大程度上影响了消费者的购买欲望。从表2可以看出，冷鲜牛肉的L*极显著高于解冻牛肉(P<0.01)，a*显著高于解冻牛肉(P<0.05)，b*差异不显著。L*表示肉样的明度，明度越大说明肉样越有光泽；a*表示肉样的红度，红度越大说明肉样颜色越鲜艳、品质越好[21]。解冻牛肉由于蛋白质变性保水性下降，水分渗出导致明度减小；由于肌肉组织中肌红蛋白发生氧化导致红度减小。

表2 冷鲜与解冻牛肉理化指标测定结果Tab.2 Results of physical and chemical indexes of fresh and frozen-thawed beef

注：同一行不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，同一行不同小写字母表示差异极显著(P<0.01)。

蒸煮损失率可以反映肌肉的持水能力，其大小与肌肉蛋白的溶解性有关。冷鲜牛肉的蒸煮损失率极显著低于解冻牛肉(P<0.01)。肉样在冻融过程中蛋白质发生变性，胶体性质被破坏，蒸煮损失增加，也表明肉样持水性变差。

2.4 牛肉超声图像及纹理特征值

图3为从冷鲜与解冻牛肉超声图像中各随机抽取的一幅图像。冷鲜牛肉图像整体反射回波强度较大，解冻牛肉图像整体反射回波强度较小；图像均一性较差，部分区域反射回波与相邻区域有较大差异。根据超声成像原理，当超声波传经两种声阻抗不同的相邻介质的界面时会发生反射，通过传感器收集处理反射回波在计算机上形成图像。故反射回波强度表现了被测样品内部质构变化的程度，回波强度越大说明样品内部质构变化程度越大。根据2.1、2.2、2.3节的分析结果可知，冷鲜牛肉组织结构较为完好，肌纤维边界明显，肌纤维与组织液组成了质构差异大的结构，因此图像整体反射回波较大；解冻牛肉组织遭到破坏，细胞液流出与组织液混合，肌纤维边界模糊，且水分大量流失发生干缩，因而内部质构差异减小，图像整体反射回波较小。采集得到的牛肉超声反射图像均一性差，这是由于样本中有未剔净筋膜和血管存在，且生物组织样本具有多样性。表3为从超声图像中提取的部分纹理特征值，可以看出冷鲜与解冻牛肉纹理特征值差异极显著(P<0.01)。其中，ASM、HOM、ENT、AVG差异最为显著。ASM是图像均匀性的度量，反映图像灰度分布均匀的程度[22]。其值大说明纹理较为均一、变化规则。HOM反映图像纹理的同质性, 度量图像纹理局部变化量[23]。其值大表明图像纹理不同区域间变化小，局部比较均匀。ENT代表了图像中纹理的非均匀程度或复杂程度。这些纹理特征值差异与所采集的超声图像差异相对应。

图3 冷鲜与解冻牛肉超声图像Fig.3 Ultrasound images of fresh and frozen-thawed beef

纹理特征值冷鲜牛肉解冻牛肉角二阶矩ASM(0°)(2.35±0.59)×10-2(3.69±0.73)×10-2相关性系数COR(0°)0.9878±0.00390.9931±0.0041逆差矩HOM(0°)0.76±0.040.83±0.03对比度CON(0°)3.51±0.871.99±0.65角二阶矩ASM(45°)(1.62±0.54)×10-2(2.72±0.63)×10-2逆差矩HOM(45°)0.64±0.040.71±0.03角二阶矩ASM(90°)(2.39±0.64)×10-2(3.66±0.72)×10-2逆差矩HOM(90°)0.78±0.030.82±0.03角二阶矩ASM(135°)(1.64±0.54)×10-2(2.76±0.63)×10-2逆差矩HOM(135°)0.64±0.050.71±0.04熵ENT5.07±0.174.66±0.23平均灰度AVG112.28±14.4796.02±12.69

注：表中数据是经单因素方差分析筛选的具有极显著差异(P<0.01)的纹理特征值。

2.5 主成分分析

主成分分析(PCA)是一种多元分析方法，可在不丢失主要信息的前提下，选择较少的新变量来代替原来较多的变量[24]，可以达到数据降维的目的。图4为冷鲜与解冻牛肉超声图像纹理特征值主成分分析的结果，前3个主成分累计贡献率达到99.71%，基本能够代表全部信息。从图中可以看出冷鲜牛肉和解冻牛肉大致可以各自聚为一类，有小部分区域发生重叠，表明超声成像技术结合PCA可以基本区分冷鲜与解冻牛肉。

图4 三维PCA主成分得分图Fig.4 Three-dimensional projection of PCA result

2.6 LDA鉴别模型

线性判别分析(LDA)也称Fisher线性判别，是一种常用的模式识别方法，其基本思想是从高维特征空间中提取出最具辨别能力的低维特征，这些特征可以帮助同类样本聚集在一起，不同类样品尽量分离[25]。

对牛肉超声图像纹理特征值进行主成分分析处理，随机选取总样本的2/3作为训练集，剩余1/3作为测试集，利用LDA进行分析。选取不同的主成分数作为模型的输入，牛肉类别(冷鲜或解冻牛肉)为模型的输出，建立LDA判别模型，结果如图5所示。当主成分数为5时，LDA模型的训练集和测试集识别率均达到100%，表明超声成像技术结合LDA模型可以很好地鉴别冷鲜与解冻牛肉。

图5 各主成分数下LDA的识别率Fig.5 Identification rate of each principal component based on LDA

2.7 SVM鉴别模型

支持向量机(SVM)是一种以统计学习理论和结构风险最小原理为基础的机器学习方法，它通过非线性映射将低维不可分样本转化到高维特征空间使其线性可分，较好地解决了小样本、非线性、高维度、局部极小等问题[26-27]。选取径向基函数作为内积核函数，通过交叉验证(Cross validation，CV)寻找最佳参数(惩罚参数c和核函数参数γ)，选取不同的主成分数作为模型的输入。通过优化得最佳主成分数为4，最佳参数c=32，γ=0.125。识别率结果如图6所示，当主成分数为4时，模型预测性能最佳，训练集识别率为95%，测试集识别率为90%。

图6 各主成分数下SVM的识别率Fig.6 Identification rate of each principal component based on SVM

3 结束语

分析了冷鲜与解冻牛肉的质构参数、微观结构和部分其他理化指标差异，解释了冷鲜与解冻牛肉超声图像差异，提取超声图像纹理特征值，建立了冷鲜与解冻牛肉鉴别模型。结果表明：冷鲜和解冻牛肉质构参数差异极显著(P<0.01)，从质构参数、微观图像和部分其他理化指标可以看出，解冻牛肉微观结构被破坏，细胞液渗出流失，肌细胞边界模糊，内部质构变化较小，致使超声反射回波较小。冷鲜与解冻牛肉超声图像纹理特征值差异极显著(P<0.01)，通过提取超声图像纹理特征值建立的识别模型中，LDA模型训练集和测试集识别率均达到100%，SVM模型训练集识别率为95%，测试集识别率为90%。LDA模型为线性模型，相对于SVM模型更加简单，容易实现。因此，超声成像技术结合化学计量学方法可以鉴别冷鲜与解冻牛肉，本研究可为超声成像技术应用于食品检测领域提供新的思路。