两种配方废弃菌棒堆肥中微生物多样性研究

代晓航 魏 超

(1.四川省农业科学院分析测试中心， 成都 610066; 2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(成都), 成都 610066)

0 引言

食用菌作为我国的第五大农作物，其产业发展已形成可持续性的趋势及特色，至2015年，其生产规模占世界产量的73.57%[1-2]。食用菌产业有效促进了中国贫困地区的脱贫致富，在一定程度上解决了“三农”问题[3]。随着食用菌产业的不断发展，产生了大量的废弃菌棒，随意丢弃的废弃菌棒，将污染土壤和水体，其对环境的影响不可低估。有机肥制作是将农业产物变废为宝的途径。废菌棒作为食用菌种植后的废弃原料，在出菇后理化结构发生变化，呈疏松多孔结构，N、P、K含量变得更加丰富，更有利于农作物的生长，同时可增加土壤微生物多样性[4-6]。以往对于农业废弃物堆肥微生物多样性研究多集中在秸秆、动物粪便、树叶等方面，而对废弃菌棒堆肥中微生物多样性研究较少[7-9]。

高通量测序的方法目前已被广泛应用于水体、土壤、疾病等微生物群落的研究中，能更真实地揭示微生物群落的复杂性和多样性，对不可培养和痕量微生物的研究具有明显优势，同时可揭示种群差异、功能特点等重要信息[10-12]。本实验以平菇菌渣为主要原料，以添加两种不同的辅料(牛粪、草炭)腐熟完成后的有机肥料为研究对象，采用高通量测序方法对样品中细菌、真菌多样性及差异进行研究，为提高以菌渣为主要原料生产的有机肥质量，以及后期肥料的使用提供相关依据和科学指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采集自四川某菌渣有机肥生产基地。堆肥为草垛式高温堆肥，高2.5 m，直径约5 m。废弃菌棒均先去菌袋等杂质，粉碎均匀后，分别添加两种类型的氮源(牛粪和草炭)，调节至相同含水率和碳氮比，进行高温发酵，经过30 d左右即腐熟完成。分别在堆肥的底部(距底10 cm处)、中部(距顶1.2 m处)、顶部(距顶10 cm处)，深度均为20～25 cm处随机取样，其中每个部位分别在堆肥的3个不同方向取样后混合为1 个样品,即每个样品获得3个平行样,编号为NJ-1、NJ-2、NJ-3(菌棒+牛粪)、CJ-1、CJ-2、CJ-3(菌棒+草炭)，样品名称编号前面加B,代表为细菌检测结果，样品名称编号前面加F,代表为真菌检测结果。样品去除杂质后封装于无菌袋中，-80℃保存，用于微生物分析。

1.2 样品DNA提取、PCR 扩增及高通量测序

使用美国OMEGA公司E.Z.N.A试剂盒进行样品DNA提取( Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美国)，用带有barcode的特异引物扩增DNA样本中16S rDNA的V3 + V4区和ITS2。16S引物序列为: 341F，CCTACGGGNGGCWGCAG;806R，GGACTACHVGGGTATCTAAT。ITS2引物序列为: ITS3_KY02F，GATGAAGAACGYAGYRAA;ITS4R，TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增体系为：50 μL反应体系中包含5 μL的10×KOD Buffer, 5 μL的2.5 mmol/L dNTPs, 1.5 μL引物(5 μmol/L),1 μL KOD聚合酶，100 ng模版 DNA。扩增条件为：95℃预变性2 min,随后98℃变性10 s,62℃退火30 s, 68℃延伸30 s，共27个循环，最后68℃延伸10 min。对扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。 将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，根据Illumina官方说明构建测序文库，Hiseq2500的PE250模式上机测序。

1.3 数据处理

1.3.1N比例过高的序列去除

去除reads中N碱基占比超过10%的序列，去除低质量序列：去除质量值高于20的碱基数占碱基总数的百分比小于40%的reads。

1.3.2Tags拼接

根据PE reads之间的重叠关系，使用FLASH(v 1.2.11)将成对双端reads拼接为一条序列。拼接条件是最小匹配长度为10 bp，重叠区域允许的错配率为2%。 拼接得到的序列称为Raw Tags。

1.3.3Tags过滤

拼接得到的Raw Tags，需要经过更严格的过滤处理后，得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime(v1.9.1)的Tags质量控制流程，进行如下操作：Tags截取，将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为小于等于3)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第1个低质量碱基位点截断；Tags长度过滤，Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。

1.3.4Tags去嵌合体

经过以上处理后得到的Tags序列与数据库(Gold database r20110519)进行比对(UCHIME Algorithm)检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。

1.4 数据分析

为了研究样品的物种组成多样性信息，用Uparse (Usearch v9.2.64)软件对所有样品的全部 Effective Tags 序列聚类。 默认将97%的一致性(Identity)序列聚类成为OTUs(Operational taxonomic units )结果， 并计算出每个OTU在各个样品中的Tags绝对丰度和相对信息，为后续的分析做准备。为了探明不同样本或者分组之间的OTUs的共有或者特有信息，根据OTU序列在各个样品中的分布情况，使用R语言的VennDiagram(v1.6.17)包和UpSetR(v1.3.3)包绘制韦恩图，并统计各个集合所包含的OTUs。稀释曲线(Rarefaction curve)用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。基于OTU列表的物种丰度信息，使用R语言的gmodels (v2.16.2)包开展主成分分析(Principal component analysis，PCA)， PCA图中的距离越近表明样品组成越相似。

1.5 统计方法

不同配方有机肥能引起微生物α多样性差异。结合分组和采样信息，通过对两组间的α多样性进行假设检验，可以分析组间的物种多样性是否存在显著差异，从而初步判断驱动群落多样性变化的潜在因素等。本次研究使用T-test检验对2个组分(NJ和CJ，每组3个重复样本)进行差异分析。P≤0.05表示差异显著，P>0.05表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 两组样品微生物多样性分析

通过对细菌16S rDNA的V3+V4区测序，菌棒+草炭(BCJ)和菌棒+牛粪(BNJ)样品分别得到134 419、125 507条有效序列， 2 839、2 969个细菌OTU。通过对真菌ITS rDNA测序,FCJ和FNJ样品分别得到了164 946、148 903条有效序列， 511、567个真菌OTU(表1)。两组样品的稀释曲线见图1。

表1 两组样品测序结果Tab.1 Results of rarefaction curve of high-throughput DNA sequencing library

图1 群落高通量测序稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of high-throughput DNA sequencing library of bacterial and eukaryotic microbial community

由图1可见，随着测序数据量的增加，分析得到的物种数量也逐渐増长,且稀释曲线已趋于平稳，说明测序基本已覆盖所有物种。另外可以看出，牛粪+菌棒配方有机肥中微生物物种丰富度高于草炭+菌棒配方有机肥，且这种差异在真菌中表现得更明显。

表1中通过比较2个处理的多样性指数可以发现，添加牛粪堆肥处理的细菌群落的丰富度高于添加草炭堆肥处理，但均匀度低于添加草炭的堆肥。添加牛粪堆肥处理的真菌群落的丰富度、均匀度均高于添加草炭堆肥处理。

通过对两组样品间的α多样性进行假设检验， 分析组间的物种多样性是否存在显著的差异，结果见表2，牛粪+菌棒配方有机肥与草炭+菌棒配方有机肥群落结构无显著差异(P均大于0.05)。

2.2 不同配方有机肥中微生物群落相似性分析

用于细菌分析的6份样品平均获得OTU 2 904条，涵盖了6门、10纲、10目、10科、10属，BNJ和BCJ之间的共有OTUs有2 042条，而两组样品特有的OTUs分别为927、797条，用于真菌分析的6份样品平均获得OTU 539条，涵盖了2门、5纲、6目、7科、4属。FNJ和FCJ之间的共有OTUs有350条，而两组样品特有的OTUs分别为217、161条(图2)。

表2 两组样品群落结构差异性分析结果Tab.2 Difference analysis results of community structure between two samples

图2 两种配方肥料中细菌和真菌群落OTU的维恩图Fig.2 Venn diagram of bacterial and eukaryotic microbial OTUs among two treatments

2.3 两种配方有机肥中群落差异分析

由图3可知，细菌PCA1和PCA2分别解释了样本86.7%和9.5%的方差信息。两者共计解释96.2%的样本信息。真菌PCA1和PCA2分别解释了样本65.9%和27.5%的方差信息。两者共计解释93.4%的样本信息。表明在这两个维度上能够反映样本的实际情况。同时，也可以看出，FNJ组内，FNJ-1距组内另外两个样品偏离较大，这可能跟样品均匀性有关，两组样品间的群落差异分析主要参考FNJ-2和FNJ-3。

根据物种分类的表达谱数据，采用热图来展示不同的物种在各样品间的表达情况，同时根据热图上的聚类关系，也可以反映样本关系。为了减少噪声数据的影响，挑选了至少一个样本的相对丰度达到0.1%以上，同时相对总丰度在前25的物种进行热图分析，见图4、5。热图中每列代表一个样本；每行代表一个分类水平；颜色从红到蓝表示丰度从高到低。

图3 群落主成分分析Fig.3 Principal components analysis of bacterial and fungi communities

图4 群落物种相对丰度聚类图Fig.4 Relative abundance of bacterial community species clustering figures at class and genus level

图5 真菌在纲和属水平上的分类Fig.5 Relative abundance of eukaryotic community species clustering figures at class and genus level

在纲水平上，BNJ相对于BCJ有3个优势菌纲，分别为Bacilli、Clostridia、S0134_terrestrial_group。BCJ相对BNJ有18个优势菌纲，分别为Alphaproteobacteria、Cytophagia、Solibacteres、Betaproteobacteria、Gemmatimonadetes、Sphingobacteriia、Mollicutes、Planctomycetacia、Verrucomicrobia、Thermomicrobia、Ktedonobacteria、Phycisphaerae、Caldilineae、Longimicrobia、Deltaprotoobacteria、Chloroflexia、Acidimicrobiia、Thermoleophilia。属水平上，BNJ相对于BCJ有10个优势菌属，分别为Bacillus、Ornithinibacillus、Oceanbacillus、Pseudomonas、Lutoimonas、Staphylococcus、Paeniclostridium、Saccharomonospora、Paucisalibacillus、Streptomyces。BCJ相对于BNJ有14个优势菌属，分别为鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、Brevundimonas、Flavobacterium、Parapedobacter、Collvibrio、Lysinibacillus、Simiduia、Iamia、德沃斯氏菌属Devosia、海洋杆菌属Pelagibacterium、Aminobacter、Mesorhizobium中生根瘤菌、Cellulosimicrobium、类芽孢杆菌Paenibacillus。

“菌棒+牛粪”配方的有机肥中芽孢杆菌(Bacillus)丰度更高。有机肥中的芽孢杆菌在土壤中可以起到增加有益微生物种类，加速和促进其他微生物对有机质累积和磷素循环过程的作用，同时，许多芽孢杆菌能分泌大量的酶和抗生素，有效控制多种植物病害[13-14]。高丰度的链霉菌属可产生多种活性物质如抗生素、杀虫剂、除草剂、植物生长促进剂[15]。

“菌棒+草炭” 配方的有机肥中的优势菌属，鞘脂杆菌属(Sphingobacterium) 能降解芳香族污染物，如多环芳香烃类物质[16-17]。这些菌可降解土壤中有机污染物和肥料中有机物，从而减少污染物危害，促进植物的生长。类芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌和梭菌属数量的增加，则有助于降解肥料中的有机物，改变土壤微生物种群结构，增加了微生物多样性[18-20]。

纲水平上，FNJ相对于FCJ有3种优势真菌，分别为Eurotiomycetes、Saccharomycetes、Tremellomycetes。FCJ相对于FNJ也有3种优势真菌，分别为Dothideomycetes、Sordariomycetes、Leotiomycetes。属水平上，FNJ相对于FCJ中优势真菌属有6种，分别为Arachniotus、Pleurotus、Aspergillus、Microascus、Scopulariopsis、Arachnomyces。FCJ相对于FNJ有4种优势真菌属，分别为Chaetomium、Gliocladium、Trichoderma、Lecanicillium。

图6 FNJ中优势真菌在种水平上的分类Fig.6 Relative abundance of eukaryotic community species clustering figure at species level

“菌棒+牛粪”配方有机肥中优势菌Arachniotus是一种白腐菌，可用于提高纤维饲料的营养价值，特别是与固态发酵技术相结合，已被用于许多废物的经济利用[21]。Aspergillus(曲霉属)也是FNJ中的优势菌属，但从种水平热图(图6)来看，曲霉属中Aspergillus_flavus(黄曲霉)和Aspergillus_subversicolor(杂色曲霉亚种)丰度较高，黄曲霉有30%～60%的菌株会产生毒素，杂曲霉毒素主要由杂色曲霉产生。有研究表明，一些农作物易受到来自土壤毒素的污染，例如土壤就被认为是花生黄曲霉菌的主要来源，花生荚果中的黄曲霉菌与土壤中的黄曲霉菌有直接联系[22-23]。

“菌棒+草炭” 配方有机肥中的优势菌Chaetomium(毛壳属真菌)能够产生大量的纤维素酶，同时还可以降解纤维素和木质素等大分子难降解有机物，具有拮抗土壤中某些微生物的作用[24]。Gliocladium(粉红粘帚霉)、Trichoderma(木霉菌)、Lecanicillium(蜡蚧轮枝菌)都是重要的生防菌。

3 结束语

选取的“菌棒+草炭”和“菌棒+牛粪”两种配方堆肥制得的有机肥微生物群落结构无显著性差异，优势菌种类有一定的差异，但功能差异不大，均可在农业灌溉中起到增加土壤微生物多样性、促进植物生长的作用。研究发现了多种具有农业价值的功能菌，可为功能性微生物的开发利用提供科学依据。另外，也发现一些潜在危害因子，如黄曲霉和杂色曲霉亚种在“牛粪+菌棒”有机肥中丰度较高，产生的黄曲霉毒素、杂曲霉毒素易造成农作物污染。因此，在生产和施用有机肥时，应考虑产毒真菌带入的风险。