由细胞凋亡途径探讨参附注射液对脓毒症小鼠心功能的影响

脓毒症是重症医学科常见的急危重症，因其发病率、住院病死率、住院费用居高不下等原因，是急危重症医学面临的重要挑战之一[1]。心功能障碍是脓毒症主要并发症之一，直接与死亡率和临床预后密切相关。脓毒症心功能障碍的发病机制非常复杂，既往研究主要集中在炎症级联反应、氧化应激、再灌注损伤等病理过程[2]。越来越多的研究表明，心肌细胞过度凋亡在脓毒症心脏功能损害过程中发挥核心作用，尤其是其造成微循环障碍、内皮损伤、免疫功能麻痹等，被认为是脓毒症心功能障碍发生的重要机制[3]。中医病因病机理论认为，“急性虚证”是脓毒症发病的关键环节，益气温阳治法在临床应用中取得了满意的效果[4]。作为益气温阳代表药物，参附注射液在脓毒症的治疗中己逐渐引起人们的关注[5]。本研究拟采用国际公认的盲肠结扎穿孔法(CLP)构建脓毒症小鼠模型，采用小动物彩超评估心脏功能，苏木精-伊红(HE)染色评价心肌病理损伤，采用脱氧核普酸转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测心脏组织中心肌损伤标记物，以初步探讨参附注射液对脓毒症模型小鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL6小鼠120只，体重(30±3)g，健康状况良好，10周龄，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2017X119231-2。实验环境设施合格证号：SYXK(粤)2001-00932；小鼠自由进食饮水，室内温度(22±2)℃，人工光暗周期12 h，所有实验均遵循相关法律法规和广州中医药大学第一附属医院实验动物伦理规范。

1.2 试剂与仪器 参附注射液购于华润三九药业有限公司；实验用血清肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和B型利钠肽(BNP)试剂盒购自上海欣普生物科技公司提供，置于4 ℃冰箱保存。碘伏、乙醇、七氟烷、生理盐水由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供。超高分辨率小动物彩色(Visualsonics加拿大)、24道生理系统记录仪(BIOPAC英国)、低温离心机(Anke TDL-5上海)等实验设备由广州中医药大学第一附属医院提供。

1.3 动物模型构建与分组给药方法 将C57BL6实验小鼠按随机数字表法分为对照组、假手术组、模型组、参附注射液组，每组30只。模型组及参附注射液组均参照国际公认方法CLP法构建小鼠脓毒症模型，其优点是该模型较其他方法更符合临床病理过程[6]。所有动物术前禁食、禁水，七氟烷麻醉后剪掉胸毛，乙醇消毒后沿前正中线切开小鼠下腹部，暴露并沿切口牵拉出盲肠约2 cm，使用8号线结扎盲肠中部，再用大号针头穿刺回盲部1 cm处，挤出适量肠内容物，回纳盲肠至腹腔后把切口缝合，涂适量红霉素于伤口处抗感染。

参附注射液组小鼠CLP术后第1天开始接受腹腔注射4 mL/kg参附注射液，共3 d。模型组小鼠于同一时点开始腹腔注射4 mL/kg生理盐水，共3 d。假手术组小鼠腹部切开再缝合，不处理肠道，术后同一时点接受腹腔注射4 mL/kg生理盐水，连续3 d。对照组小鼠不做任何处理。实验过程中动物处置方法符合动物伦理规范和标准。

1.4 心脏彩超评价心功能 每组随机取10只小鼠，采用Vevo 2100超高分辨率小动物超声检测各组小鼠左室舒张末期内径(LVDD)、左室收缩末期内径(LVSD)，并根据内置程序计算左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS)，取3次测量的均值并记录[7]。

1.5 心肌损伤标记物测定 每组随机取10只小鼠，经实验小鼠腹主动脉采血 1 mL，在恒定4 ℃和5 000 r/min条件下离心5 min，取上清，采用ELISA法测定血清cTnI、CK-MB和BNP浓度，所有试验操作严格按照有关说明书进行。

1.6 病理染色 小鼠七氟烷麻醉后立即开胸分离心脏，切取左心室，用二甲苯浸洗3次，再用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、65%)处理1次，进行HE染色，使用OLYMPUS IMAGING观察心脏组织病理学改变。

石蜡切片包埋脱水后，用蛋白酶K和过氧化氢室温孵育后加入TUNEL反应液，冲洗后滴加二氨基联苯胺(DAB)溶液，染色后OLYMPUS IMAGING观察心肌细胞核呈现棕黄色即为凋亡细胞。使用Image J随机选取10个视野记录棕黄色细胞数目和细胞核总数，计算凋亡指数。

2 结 果

2.1 心功能比较 造模72 h后，与对照组和假手术组比较，模型组小鼠心率增加，左心室肥大，表现为LVSD及LVDD明显增加，左心室功能抑制，即LVEF及LVFS显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。腹腔注射参附注射液3 d后，参附注射液组与模型组比较，心率、左室LVSD及LVDD下降，LVEF及LVFS提高，差异均有统计学意义(P<0. 05)，提示参附注射液可有效改善盲肠结扎穿孔小鼠心脏心肌活动从而改善心功能。详见表1。

表1 各组小鼠心功能比较(±s)

与对照组、假手术组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.2 心肌损伤标记物水平变化 对照组和假手术组cTnI、CK-MB、BNP比较差异无统计学意义；模型组血清心肌损伤标记物cTnI、CK-MB和BNP浓度较对照组和假手术组均有明显升高(P<0. 05)，参附注射液组血清心肌损伤标记物cTnI、CK-MB和BNP浓度较模型组显著降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠心肌损伤标记物比较(±s)

与对照组、假手术组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.3 心肌组织病理改变 对照组及假手术组小鼠心肌结构和形态无异常，细胞排列有序、致密，细胞无肿胀。模型组小鼠心脏组织出现明显的病理损伤：组织结构破坏，部分心肌细胞水肿，肌纤维排列紊乱，大量炎症细胞浸润明显，且存在碎裂的细胞核。与模型组比较，参附注射液组小鼠上述心脏组织病理学损伤得到不同程度的缓解，心肌结构尚存在，心肌细胞排列较整齐，细胞肿胀程度减轻，炎症细胞浸润减少，未见出现明显细胞核碎裂的现象。详见图1。

图1 各组小鼠心肌组织病理学改变(HE，×40)

2.4 各组小鼠心肌细胞凋亡情况比较 造模后72 h小鼠心肌组织TUNEL染色结果显示：对照组和假手术组呈现较少心肌凋亡细胞的现象，而模型组和参附注射液组均出现不同程度的细胞凋亡，但参附注射液组凋亡的心肌细胞明显少于模型组。根据IMAGEJ计算凋亡指数，模型组为(55.48±9.20)%，而参附注射液组为(30.12±7.30)%，两组比较差异有统计学意义(P<0. 05)，提示参附注射液具有一定的抑制脓毒症小鼠心肌细胞凋亡的作用。详见图2。

图2 各组小鼠心肌细胞凋亡情况(TUNEL，×40)

3 讨 论

脓毒症病人常常合并心功能障碍，并严重影响预后[8]。国外学者在20世纪80年代依据血流动力学测量数据提出感染性休克病人存在心肌顿抑的情况，影响射血分数等心脏舒张和收缩功能，表现为早期高代谢和晚期低动力循环的病理生理状态，而维持正常的心功能和血流动力学是成功救治脓毒症的关键[9]。本实验证实与对照组和假手术组相比，模型组小鼠心率增加，LVEF和LVFS明显下降，LVDD和LVSD增加，室壁活动幅度下降，提示实验小鼠经过CLP刺激后，超声多普勒结果表现出心脏收缩舒张功能受到明显抑制；而经过参附注射液腹腔注射后，与模型组比较心功能显著改善，具体表现为LVDD、LVSD减小，LVEF、LVFS提高。

cTnI及BNP为心肌病理性损伤的敏感指标，因其实用性广泛应用于临床，通过动态监测cTnI及BNP水平和心脏彩超可以对脓毒症预后做出判断[10]。本研究也发现在脓毒症发生发展的病理生理过程中，心肌损伤标志物cTnI、CK-MB及BNP水平明显升高，心脏HE染色病理结果也证实了心肌细胞肿胀，肌纤维撕裂、紊乱，大量中性粒细胞浸润，部分可见嗜酸性变和空泡样变，提示脓毒症状态对心肌细胞造成严重损伤。这与国内外其他学者报道的脓毒症CLP模型心脏病理性损伤结果相一致[11-12]。本研究证实脓毒症小鼠经过参附注射液治疗后心肌损伤减轻，表现为心肌损伤标志物cTnI、CK-MB及BNP水平显著下降，病理染色提示心肌细胞排列整齐、无肿胀，中性粒细胞浸润减轻，证实参附注射液可以抑制脓毒症心肌损伤。以往的观点认为，控制心室率药物如β受体阻断剂存在负性肌力作用[13]。本研究发现在应用参附注射液治疗后小鼠心率明显减慢，但脓毒症心功能障碍情况反而得到显著改善，这说明参附注射液能够抑制肾上腺素能系统，而进一步获得相对稳定的血流动力学状态。

除此之外，参附注射液改善脓毒症心功能状态与减轻炎性反应、抑制心肌凋亡有关。既往研究结果表明，参附注射液可通过减少炎症细胞因子生成来发挥抑制细胞凋亡的作用[14]。细胞凋亡是机体在缺血缺氧、炎症瀑布、氧化应激等条件下由B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和胱天蛋白酶(Caspase)等家族基因控制的细胞自主的有序化死亡[15-16]。心肌细胞凋亡的紊乱与脓毒症心功能障碍的发生、进展有直接关系，即脓毒症过程中内毒素释放可以引起心肌细胞凋亡，引起心肌结构和功能异常，导致心功能不全[17]。心肌细胞凋亡具有复杂的分子生物学机制，通常而言膜受体通路信号传导系统传递凋亡信号以及激活半胱天冬蛋白酶家族成员来执行水解底物的级联反应。Bcl-2蛋白家族是心肌细胞凋亡过程中重要的调节蛋白，其家族成员之间可形成同源二聚体，在细胞凋亡信号通路上发挥分子开关作用，促进凋亡的发生或阻遏通道的开放而抑制凋亡的启动[18]。本研究发现小鼠在经过盲肠结扎穿孔后Caspase-3大量表达，而参附注射液干预后Caspase-3表达下降。因Caspase-3大量表达可以激活脱氧核糖核酸酶而引起DNA片段化，其在心肌细胞凋亡过程中也发挥关键作用。本研究发现，Caspase-3活性与心肌损伤标记物cTnI、CK-MB及BNP和心肌细胞凋亡指数变化趋势一致，提示参附注射液可能通过抑制Caspase-3的活性从而降低脓毒症状态下心肌细胞凋亡的发生。

参附注射液是植物源性中药注射剂，是临床上常用的具有益气温阳作用的药物。复习文献表明参附注射液具有调节机体免疫，增强细胞代谢并且改善血流动力学等多方面的功效，发挥多脏器的保护作用[19-20]。本实验证实，参附注射液可以抑制脓毒症诱导的心肌细胞凋亡、减轻心肌病理损伤、改善心功能障碍并稳定血流动力学参数。但参附注射液抑制心肌细胞凋亡的机制有待进一步深入研究。