脑梗死合并微出血与MMP-9基因分布异常的相关性研究

脑梗死致残率及死亡率逐年增高，抗栓及溶栓治疗是脑梗死最主要的药物治疗，然而，出血转化是脑梗死的重要并发症，严重影响脑梗死病人的预后[1]。脑微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是一种亚临床的脑内微小血管病变，磁共振成像(MRI)普通序列扫描可无任何异常，仅在梯度回波及磁敏感(SWI)序列表现为小范围(直径<10 mm)圆形或斑点状低信号[2]。即使出现这些影像学病灶，病人也可无任何临床症状。近年来随着磁共振磁敏感等序列的开展，CMBs被逐渐重视。临床研究显示在脑梗死及短暂性脑缺血发作(TIA)病人中发生率可达30%以上；而在脑出血病人中CMBs发生率可超过50%[2]，且CMBs与遗传及种族也有一定相关性，在亚洲人群中CMBs发生率较高。CMBs病人中症状性颅内出血及高血压发生率可明显增高，越来越多的研究显示CMBs可能是脑出血转化的一个重要指征[2]。因此，对CMBs的研究具有重要临床意义。关于CMBs对脑微结构病理生理改变的机制目前仍不十分确定，CMBs对血脑屏障的破坏可能是脑组织病变的关键点[3]，而基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是血脑屏障的重要标志物。因此，本研究探讨脑梗死合并微出血与MMP-9基因分布异常的关联性，为脑梗死的治疗提供一定的临床依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年6月-2017年8月在我院神经内科及脑血管病科住院的急性脑梗死病人158例，其中男97例，女61例；年龄28～87(66.9±25.2)岁。对急性脑梗死病人进行MRI常规序列(包括DWI、T1WI、T2WI及SWI)。入组标准：①年龄18～80岁；②首次患脑梗死且发病在24 h以内；③汉族；④急性脑梗死的诊断参考“中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014”[4]并经DWI证实；⑤CMBs在SWI序列表现为圆形或者椭圆形的低信号，直径2～5 mm，在T1WI及T2WI像上无高信号表现，并且排除其他伪像，如苍白球钙化等；⑥病人或家属签署知情同意书。排除标准：①颅内血肿、颅内肿瘤及外伤；②存在其他严重疾病可能导致随访脱落；③接受溶栓治疗及血管内介入治疗病人；④伴有严重精神疾病；⑤不能耐受MRI检查者，如心脏起搏器、金属植入物、空间幽闭症。根据SWI结果将病人分为CMBs组、非CMBs组。其中CMBs组66例，非CMBs组92例。

1.2 研究方法

1.2.1 基线资料收集 详细记录病人一般资料，如身高、体重、生活习惯、高血压、糖尿病史、美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分及血液检测结果。计算体质指数。所有病人在发病24 h内均进行MRI检查，包括常规T1、T2、FLAIR、DWI序列及SWI序列。

1.2.2 CMBs的诊断 采用美国通用电气公司1.5T超导型磁共振扫描，使用八通道相控阵头线圈，常规序列T2WI扫描参数：TR/TE=5 000/89，FLAIR扫描参数：TR/TE=9 000/89，T1WI 扫描参数：TR/TE=500/8.4。层间距4 mm，层厚6 mm，矩阵256×177，FOV 23 cm×20 cm，扫描16层。轴位三维磁敏感序列扫描参数：TR 49 ms/TE40 ms，反转角15°。矩阵256×177，视野20 cm×23 cm，总扫描56层。通过实时在线技术自动生成图像，并输送到工作站，完成最小密度投影后进行图像重建处理。CMBs诊断标准为SWI可见直径2～10 mm黑色低信号区域，规则椭圆形或圆形、密度均等、界限相对清晰，周边无水肿。CMBs排除标准：海绵状血管瘤、铁沉积或钙化及血管周围间隙扩张等。由两位放射科神经组高年资医师独立阅片，如意见有分歧，双方讨论后确定诊断。

1.2.3 血清MMP-9、血脂及血糖水平检测 所有纳入病人于入院后抽取空腹血5 mL，其中2 mL测定血清MMP-9水平、血脂及血糖。采用酶联免疫吸附法检测血清MMP-9水平。另外3 mL放入-20 ℃低温保存，用于提取DNA。

1.2.4 基因组DNA提取 通过NaI提取法，提取外周血白细胞DNA，严格依照试剂盒说明书步骤进行。

1.2.5 采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术测定MMP-9基因SNP位点 根据PubMed及prim5软件设计MMP-9 C562T引物。引物上游：5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′；引物下游：5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC - 3′。

1.2.6 PCR扩增 PCR反应体系如下：总量50 μL包括正向引物1 μL、反向引物1 μL、模板DNA 8 μL、脱氧核糖核苷三磷酸4 μL、Taq聚合酶1 μL、双蒸水30 μL、上样缓冲液5 μL。PCR反应控温条件如下：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30个循环后，72 ℃再延伸5 min。PCR扩增后产物使用限制性内切酶SphI 2 U在37 ℃环境消化3 h，然后经4%琼脂糖凝胶电泳检测MMP-9 C1562T基因型。

2 结 果

2.1 两组病人临床资料比较(见表 1) 两组性别、糖尿病、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、吸烟、饮酒、体质指数、入院时NIHSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。而年龄、高血压、血清MMP-9水平差异有统计学意义(P<0.05)。提示年龄、高血压、MMP-9水平与微出血密切相关。详见表1。

表1 两组病人临床资料比较

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 对MMP-9 C1562T 基因位点进行检测，CMBs组和非CMBs组中各种基因均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，差异无统计学意义(χ2=4.681，P=0.097；χ2=2.162，P=0.249)。表明本研究样本具有群体代表性。

2.3 两组MMP-9基因C1562T等位基因和基因型频率分布 PCR扩增产物经限制性内切酶酶切后，经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，分为3种基因型：纯合子CC基因型(电泳存在435 bp一条带)；杂合子CT基因型(电泳存在435 bp、247 bp、188 bp三条带)；纯合突变子T/T基因型(电泳存在247 bp、188 bp两条带)。 CMBs组MMP-9基因1562的CC、CT、TT基因型构成比分别为63.64%、25.76%、10.61%；非CMBs组MMP-9基因1562的CC、CT、TT基因型构成比分别为41.30%、43.48%、15.22%；两组的基因型分布差异有统计学意义(χ2=7.745，P=0.021)。CMBs组MMP-9基因1562的CC基因型频率高于非CMBs组，差异有统计学意义(χ2=7.668，P=0.006)。CMBs组MMP-9基因1562的C和T等位基因频率分别为76.52%、23.48%，非CMBs组分别为63.04%、36.96%，两组基因频率差异有统计学意义(χ2=6.484，P= 0.011)。两组CT+CC及CC+TT基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

2.4 两组不同基因型MMP-9血清水平比较 单因素方差分析显示，CMBs组CC、CT和TT基因型有MMP-9水平比较差异有统计学意义(F=3.912，P=0.038)；非CMBs组CC、CT和TT基因型MMP-9血清水平比较差异无统计学意义(F=1.359，P=0.172)；CMBs组CC基因型MMP-9水平高于非CMBs组(P<0.05)。详见表3。

表2 两组MMP-9基因C1562T基因型分布及等位基因频率比较 例(%)

表3 两组不同基因型MMP-9血清水平比较(±s) ng/mL

2.5 多因素非条件Logistic回归分析 将发生CMBs作为因变量，纳入单因素分析中P<0.1的变量，将年龄、高血压、低密度脂蛋白、入院时NIHSS评分、血清MMP-9水平作为自变量，作多因素非条件Logistic回归分析。其中高血压、年龄及C等位基因有统计学意义(P<0.05)，入选主效应模型变量。多因素非条件Logistic回归分析显示，高血压、年龄及C等位基因是影响预后的独立危险因素(P<0.05)。详见表4。

表4 影响CMBs的多因素Logistic回归

3 讨 论

CMBs是一种含铁血黄素沉积导致的颅内微血管破裂，主要发生在脑动脉穿支分布区，其发生机制仍不明确，研究认为与血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏有紧密的联系[5]。BBB由星形胶质细胞终足、基底膜以及内皮细胞等结构组成，是脑组织及脑脊液与血液之间的特殊屏障，可阻止血液离子及溶质和脑细胞之间的随意交换，有利于维持脑组织理化环境的稳定。CMBs病人微血管基质膜溶解脱落，血管内皮细胞间隙增宽，细胞外间质明显降解，从而导致血脑屏障通透性增加[6]，且随着血脑屏障的破坏，血液成分不断渗漏，脑出血转化的风险明显增加。脑梗死病人起病后需立即进行抗凝药物或抗血小板聚集治疗，既往研究显示，与无微出血病人相比，抗栓或溶栓治疗在微出血病人中会明显增加脑出血性转化风险[7-8]。另外，已经出现脑出血转化的脑梗死病人中，多数病人起病前已经使用过抗血小板聚集和抗凝药物。除了可导致脑出血外，CMBs是认知功能障碍的独立危险因素[6]，CMBs病人出现认知功能受损的风险也明显增加，CMBs病人认知功能障碍的主要表现为执行能力下降、注意力进行性下降、视空间功能减退[9]。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一种与锌有关的金属蛋白酶，在组织修复重塑、细胞增殖及迁徙、新生血管形成过程中发挥重要作用。其中MMP-9 是MMPs的主要家族成员，广泛分布于脑组织的基底膜、脑血管的内皮细胞及胶质细胞等部位，最主要的作用是降解和重构细胞外基质，使血管壁间隙扩大，通透性增加，促使纤维蛋白等大分子透过血管间隙渗透至脑组织[10]。本研究中，单因素分析显示，微出血与MMP-9血清水平明显相关。既往研究也证实了MMP-9与血脑屏障破坏及脑出血转化的相关性。Egashira等[11]研究显示，野生型蛛网膜下腔出血(SAH)小鼠白质血脑屏障破坏(白蛋白渗漏)，MMP-9活性在SAH后24 h升高，与WT小鼠相比，SAH后MMP-9 敲除小鼠有较少的白质T2高信号，蛛网膜下腔出血后第8天，正常小鼠髓鞘完整性降低，MMP-9 敲除小鼠白质损伤减少。Castellanos等[12]研究显示血清MMP-9水平是急性脑梗死出血转化的独立预测因素。Singh等[13]研究认为，基质金属蛋白酶介导了α2-抗纤溶酶对实验性卒中血脑屏障的破坏和缺血性脑损伤的有害影响。组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)超过时间窗内(4.5 h)可加重缺血性卒中后出血性转化的危险性(HT)和神经毒性，黄芩苷可通过抑制过氧亚硝基阴离子介导的MMP-9活性减轻超过时间窗使用注射用阿替普酶(rtPA)导致的出血转化，提高缺血性脑卒中治疗的结果[14]。另有研究也认为，缓激肽受体1R(B1R)可能通过激活ERK1/2/NF-κB通路/ MMP-9通路促进1型糖尿病大鼠脑梗死后缺血再灌注诱导的血脑屏障破坏及脑出血转化[15]。Toll样受体4参与原位血栓性脑梗死延迟rt-PA给药引起的出血转化，很可能是通过增加MMP-9的表达来实现的[16]。

人类MMP-9基因位于16q11.2-13.1，全长7.7 kb，含13个外显子。MMP-9 C1562T基因多态性是位于MMP-9基因转录启动子上游的1562位点原有的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，该基因分布的异常可能在转录水平改变酶蛋白生成的数量，并使该结合位点构型出现改变，从而在转录水平与转录阻遏MMP-9蛋白结合的能力发生改变，导致启动子的转录活性增高，最终促进蛋白质的明显表达[17]。基于启动子是参与特定基因转录及其调控的重要DNA序列，MMP-9基因的分布异常可能直接改变靶点基因的转录水平。关于MMP-9 C1562T多态性与脑梗死的相关性有较多研究，但是微出血与MMP-9 C1562T多态性的相关性尚未报道。既往大量研究显示，该位点基因分布的异常可促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖、血管壁细胞外基质降解、炎性细胞的趋化和浸润、纤维帽的破裂等病理生理变化，促进一系列急性心脑血管事件的发生[18-19]。本研究显示，CMBs组MMP-9 1562 C等位基因及CC基因型频率明显高于非CMBs组，多因素Logistic回归分析也显示，C等位基因是脑微出血的独立危险因素，且CMBs组CC基因携带者血清MMP-9水平明显高于CT及TT基因型。Zhang等[20]研究结果显示，MMP-9基因-1562c / T多态性与脑卒中的出血性转化明显相关，并认为，T等位基因可能是该人群出血转化的保护因子。与本研究结果相似。然而，也有研究认为T等位基因与出血转化相关。刘丹等[21]研究显示，MMP-9 C1562T的T等位基因以及MMP-2 C735T的C等位基因是脑梗死的遗传易感基因，同时MMP-9 C1562T的T等位基因也是脑出血的遗传易感基因。Wang等[17]研究认为，MMP-9 C1562T 基因多态性与冠心病的发生存在显著的种族差异性，在东亚人群中，MMP-9 1562 T等位基因与冠心病的发生明显相关；而在西亚人群及西方人群中，MMP-9 C1562T 基因多态性与冠心病的发生无密切相关性。这些不同的基因分布与出血转化的相关性，可能与种族、环境、生活方式相关。本研究与既往研究的差异可能与以下因素有关。首先，本研究只分析了MMP-9最典型的基因位点C1562T，MMP-9其他基因位点的分布可能也与脑微出血相关，而且既往研究也显示，不同的基因位点的异常分布也有交互影响作用。其次，血清MMP-9水平可能与脑梗死不同阶段相关，脑梗死早期的应激反应也可能影响MMP-9水平，因此动态监测MMP-9水平的变化可能更能准确反映MMP-9水平与脑梗死及微出血的相关性。再者，脑微出血存在轻、中、重不同程度，不同程度的微出血与MMP-9的基因分布是否相关，值得进一步研究。最后，基因分布的异常是否与微出血病人的出血转化及认知功能下降等预后直接相关，也需要进一步研究。

总之，本研究结果显示MMP-9基因启动子区C等位基因与脑梗死合并微出血有相关性，MMP-9基因启动子区C等位基因可能是脑微出血的独立危险因素，微出血病人CC基因型携带者MMP-9血清水平明显增高，这为探讨CMBs的机制提供一定的理论依据。