EB病毒核酸定量检测试剂性能验证及评价

曲 沛，郭 杰，徐新民，焦炳欣，郭晶晶，方 茜，王雅杰

（首都医科大学附属北京地坛医院，北京100015）

EB病毒（EBV）又称人类疱疹病毒4型，可引起传染性单核细胞增多症，并与鼻咽癌、NPC伯基特Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤及多发性硬化症的发生关系密切［1-2］。因此EB病毒的检测对于相关疾病的诊断和预后都具有非常重要的意义。本研究通过对EB病毒定量核酸检测系统的性能验证，以评估EB病毒定量检测试剂的分析性能及其临床应用价值。

材料和方法

1 标本来源

标本收集来源于首都医科大学附属北京地坛医院检验科不同浓度的临床全血标本及已知浓度临床检验中心质控品（批号为20180412），于-20℃冰箱保存。

2 仪器与试剂

仪器：宏石SLAN-96P。试剂：圣湘EB病毒核酸定量检测试剂（批号2017007）及配套的核酸提取纯化试剂盒。

3 性能验证指标及验证方法

根据中华人民共和国卫生行业标准（WS/T）492-2016文件进行精密度和准确性验证。

3.1 准确性 测定来自卫生部临床检验中心提供的已知浓度的室间质控品，其浓度水平覆盖检测方法的可报告范围，连续检测2次，计算均值（±s）和偏倚，用以验证试剂盒的准确性。

3.2 精密度 批内精密度：选择浓度为106IU/mL和103IU/mL的临床全血样本各1例，在同一批实验中重复测定20次；批间精密度：将高、低浓度106IU/mL和103IU/mL两个水平的标本，在同一批试验中重复检测5次，连续检测4 d，每个水平共收集20个数据；如果出现失控，则应删除数据并重新测定。分别统计两个水平标本检测值的均值和标准差，再计算CV值。

3.3 线性范围 选择临床5.94×106IU/mL的全血样本，提取好后用核酸释放剂按10倍梯度稀释至101，对高值阳性标本和稀释后的标本进行同批次检测，每个标本重复检测3次，对测定值和理论值进行线性回归分析，要求满足b在1+0.05范围内，a接近于0，R2≥0.95［3-4］。

结 果

1 准确性验证结果

用来自卫生部临床检验中心提供的已知浓度的室间质控品进行准确性验证，计算其均值和偏倚，所有样本均达到偏倚≤7.5%的标准，准确性验证符合要求。实验结果记录见表1。

表1 准确性验证结果

2 精密度验证结果

2.1 批内精密度验证结果 采用浓度范围为106IU/mL和103IU/mL的高、低两个水平临床样本，在同一批试验中重复检测20次；分别统计两个水平标本检测值的均值和标准差，再计算CV值。高低浓度对数值的变异系数分别为0.58%和2.3%，均符合CNAS-CL36规定的CV≤5%的要求。实验结果记录见表2。

表2 批内精密度验证结果

续表

2.2 批间精密度验证 采用浓度范围为106IU/mL和103IU/mL的高、低两个水平临床样本各1例进行批间精密度的验证。分别统计两个水平标本检测值的均值和标准差，再计算CV值。高低浓度对数值的变异系数分别为2.25%和0.49%，均符合CNAS-CL36规定的CV≤5%的要求。实验结果记录见表3。

表3 批间精密度验证结果

2.3 线性范围验证结果 将高值阳性标本6.58×106IU/mL梯度稀释至6.58×10IU/mL，结果如表4和图1所示，实际值和理论值的回归方程是Y＝1.015X-0.0563（R2＝0.9996≥0.98），满足b在1+0.05范围内，a接近于0，R2≥0.95，线性范围为6.58×10～6.58×106IU/mL。试剂说明书的定量线性范围为4.00×102～4.00×109IU/mL，验证合格。

表4 线性验证结果

图1 线性回归方程

讨 论

EB病毒是一种嗜B淋巴细胞的人类疱疹病毒，属于DNA病毒的一种，具有传染性强和潜伏感染的特点。EBV感染后，30%的患者可出现咽峡部溶血性链球菌感染，13%的患者发生急性肾炎，6%的患者发生心肌炎，1%的患者发生脑炎。部分患者因并发脾破裂、脑膜炎、心肌炎、肺炎、继发感染而死亡［5］。

自1999年KIMURA等［6］首先发表EB病毒RT PCR检测方法以来，至少有25个不同的实验室开发出不同的检测方法，在美国、欧洲和中国至少有10种商业EBV-DNA检测PCR试剂盒在销售，国际上报道的定量和半定量的检测结果单位各不相同，对EBV的研究工作造成了一定的影响［7］。

因为RT-PCR技术定量结果的影响因素众多，包括目的基因的选取、引物和探针的设计，PCR设备、预混酶试剂的成分、PCR循环数、标准品的选择等多个方面，目前由于各研究中心间方法学的差异，因此见诸报道的定量结果差异极大。2011年WHO发布首个EBV-DNA检测的国际标准，使得不同国家、不同实验室之间的结果具有可比性，起到积极的作用［8］。

本文通过对EBV定量检测试剂的精密度、准确性及线性范围进行验证，评估试剂的分析性能。验证结果表明，在3.8×103IU/mL和1.35×106IU/mL浓度范围具有较好的批内精密度和批间精密度，符合CNAS-CL36的要求；在7.74×10～6.71×106IU/mL分析测量范围线性关系良好。

为了保证检测结果的准确性，参考GB/T22576-2008标准，明确了临床实验室在使用厂家的检验方法和试剂盒时，还要验证相关的分析性能，以证实本实验室能否达到的厂家声称的分析性能指标。依据GLIA88要求，临床实验室可只对下面三项主要分析性能进行验证：准确性、精密度、线性范围。

研究结果显示试剂盒的准确性高，精密度好，线性范围符合说明书要求，参考区间有效，能够满足临床检验的需求。