数字病理扫描在颈动脉粥样硬化斑块组织学研究中的应用

曹敬丽，孙 杰，Marina S.Ferguson，张 东，沈 宓，隋滨滨，刘 丽，李子瑞，赵锡海，Thomas S.Hatsukami，苑 纯，，，高培毅，4，王雅杰，6

（1.首都医科大学附属北京天坛医院 国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京100070；2.美国华盛顿大学血管成像实验室，美国 西雅图90876；3.清华大学医学院生物医学影像研究中心，北京100084；4.北京市神经外科研究所，北京100070；5.脑血管病转化医学北京市重点实验室，北京100070；6.首都医科大学附属北京地坛医院，北京100011）

颈动脉粥样硬化斑块的形成是脑血管病变的独立危险因素之一［1-2］。动脉粥样硬化斑块主要分为两类：稳定斑块和易损斑块。稳定斑块一般具备纤维帽厚、脂质核小、炎症反应轻等特点，不易形成缺血事件。易损斑块破裂危险高，形成血栓栓塞的危险性也高，并可导致管腔狭窄、闭塞、斑块内出血等，容易发生缺血事件［3-4］。对颈动脉粥样硬化斑块进行充分的组织学判读和研究，将有助于通过全面把握斑块的组织学表现进而推进临床辅助诊断的改进［5］。随着数字化病理的发展，数字病理扫描仪在组织切片的扫描质量和分析功能上也在迅速的提升［6］。数字病理扫描应用于颈动脉粥样硬化斑块组织学切片，将有助于科研工作者对颈动脉粥样硬化斑块的组织学表现快速全面地掌握，进而对组织学进行充分地判读和分析。本文中，我们将介绍一下数字病理扫描在颈动脉粥样硬化斑块组织学研究中的应用，便于有相同科研需求的同行引用和参考。

材料和方法

1 标本来源

颈动脉粥样硬化斑块横断面切片所需的颈动脉粥样硬化斑块取自首都医科大学附属北京天坛医院CEA手术，样本取材获得了伦理委员会的批准和病人的知情同意。

2 实验试剂和耗材

苏木素，伊红，中性树胶封片剂，盖玻片，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；无水乙醇、二甲苯、1%盐酸酒精分化液和1%氨水反蓝液，均购自北京益利精细化学品有限公司。

3 主要仪器

数字病理扫描仪，Leica Aperio CS2（德国徕卡）。

4 方法

4.1 H&E染色 取颈动脉粥样硬化斑块的切片，于60℃烘烤30min，趁热浸入二甲苯15min×2，充分脱蜡。然后，经梯度酒精浓度从高到底，即100%酒精10min×2，95%酒精8min×2，85%酒精5min，75%酒精5min，完成水化。水化后将组织切片浸没在苏木精中染色10min，以蒸馏水速洗，用1%盐酸酒精分化6-8s，以蒸馏水速洗，用1%氨水反蓝1-2min，以蒸馏水漂洗2遍，伊红染色5min，蒸馏水速洗，完成染色，上述步骤均常温进行。染色结束后，经梯度酒精浓度从低到高脱水并二甲苯透明后用中性树胶封片，晾干，室温保存。

4.2 数字病理扫描 待封片后的切片晾干后，可进行数字病理扫描。扫描前，按正确的顺序开机扫描仪和电脑，并启动扫描专用的软件，启动过程中等待系统成功完成启动和自检，使电脑可通过软件操作调整扫描设置。扫描时，将待扫描的切片正确置于数字病理扫描仪的切片架上，系统会对待扫描的组织切片进行预览并识别出待扫描的区域。通过预览图像可观察到自动识别的准确性，对于识别区域与组织切片所在的位置有偏差的样本，可依据组织的位置和轮廓来校准扫描的区域，仪器可对校准后的扫描区域自动对焦进行扫描。鉴于组织切片在不同位置聚焦点略有差异，在待扫描的区域适当增加聚焦点将有助于扫描出全景均清晰的图像。通过对组织切片实行数字化扫描，获得组织全层面图像，将图像妥善保存在硬盘上，供后续阅读和分析使用。

结 果

1 数字病理扫描所得的图片有助于全面地掌握和保存颈动脉粥样硬化斑块组织切片的全层面信息

通过数字病理扫描获得的图片，在图片的任何部位均可放大浏览和查看。如图1A所示，数字病理扫描后可获得斑块组织切片全层面的高质量图片，在该图片上，可以用鼠标作为辅助工具移动和浏览图片，可以对图片任意位置放大和缩小以便于浏览细节和全貌，其放大的倍数取决于扫描时所选择的物镜倍数，在本扫描系统中，最大可达到40×光学放大。鉴于动脉粥样硬化斑块组织成分组成的复杂性，本项扫描有助于科研工作者迅速掌握斑块切片全层面的组织学表现，亦有助于数字化之后的组织学信息永久性地保存。如图1 B&C所示，可对组织切片的任意部位进行适当的放大显示，以便于辅助阅读组织成分的细微之处。本文以图1 B&C为例展示局部20×光学放大后的显示效果。图1 B为斑块内血栓，从图像可看出，血栓大部分已出现机化，并且，与血栓相邻的区域，存在着较丰富的大小不等的泡沫细胞，随着病情的进展，此处发展为脂质坏死核的可能性大。相比于MRI和超声影像，组织学判读能看到更丰富的细节表现，进而更精确地辅助判断斑块所处的分期。图1 C为斑块内局灶性出血表现，从图像可以看出较丰富的新鲜红细胞渗透入斑块基质内，在科学研究中，结合斑块连续切片中相邻层面的表现，将有助于综合判断该出血灶在斑块中的体积以及对斑块稳定性的影响。

图1 数字病理扫描所得的图片有助于全面地掌握和保存颈动脉粥样硬化斑块组织切片的全面信息

2 数字病理扫描获得的图片在软件的帮助下有助于非常方便地测量斑块内各成分的大小

数字病理成像时，系统会为图片自动生成比例尺，比例尺可依据图像放大倍数的不同而自动调整。系统也会自带测量工具，方便测量。如图2所示，①为与图1C相同的区域，为一小的渗血灶，我们可以借助于软件中自带的测量工具对该渗血灶的任意直径作出精确的测量，可精确到μm，如图2①所示，本层面渗血灶最宽处的横径为473.1μm。图2②所示为纤维帽的厚度，借助于测量工具，我们可以任意测量纤维帽最厚的地方和最薄的地方相关的厚度值，进而在研究工作中辅助判断斑块的稳定性，本次测量的纤维帽厚度是791.0μm。结合JESSICA等的研究结果［7］，颈动脉粥样硬化斑块纤维帽厚度小于200μm时不稳定。从图像中测量处的右侧可以看出，本层切片中的纤维帽有更薄的地方。本次测量仅用于示例软件在纤维帽厚度测量中的方法，若涉及评估斑块纤维帽的稳定性，则需要挑出纤维帽最薄的位置做出测量。图2③所示为纤维帽所覆盖的不稳定成分，本层图片显示纤维帽所覆盖的成分组成比较复杂，即含有机化的血栓，也含有进展中的脂质坏死成分，其过大的体积参与了斑块不稳定性，本次测量的其最大的厚度直径是2.263mm。图2④所示为陈旧的斑块内出血，最厚的地方是1.324mm。图2⑤所示浅染区域为脂质池，在动脉粥样硬化斑块中，脂质池比较稳定，本图所示测量其厚度为528.9μm。在MRI中，脂质池与脂质坏死核呈现相同的信号，在组织学判读中，我们可以清晰地看出脂质池与脂质坏死核的组成成分并不同，相比之下，充分的组织学研究更有助于对斑块组成成分的精准判读和分析。

图2 数字病理扫描获得的图片在软件的帮助下有助于非常方便地测量斑块内各成分的大小

图3 数字病理成像有助于精确评估斑块的狭窄程度

3 数字病理成像有助于精确评估斑块的狭窄程度

如图3所示，本层切片中，斑块最厚处的管腔直径为2.655mm，全径（斑块+管腔）为7.854mm，在本层图片计算斑块的狭窄率为（1-2.655/7.854）×100%＝66%，如此，测量评估获得本层面切片斑块的狭窄率为66%。若精准的评估本斑块整体的狭窄率，需结合颈动脉粥样硬化斑块冠状切面连续切片后不同层面的信息综合分析获得。本文通过图中层面展示数字病理成像系统测量和评估的方法。

讨 论

随着人工智能的发展［8-10］，人工智能将逐渐应用于MRI等影像学辅助诊断［11-13］。对于颈动脉粥样硬化斑块，人工智能将有助于高效率地判断斑块成分，并较准确地辅助预测斑块稳定性。通过颈动脉粥样硬化斑块连续切片所获得的数字病理图像，结合MRI信息，有助于对组织学与MRI进行相同层面的比对，比对后将有助于对斑块成分的精准判断与精确评估。在人工智能的训练方面，结合数字病理扫描所获得的颈动脉粥样硬化斑块各层面的组织学信息，将有助于提高MRI影像学人工智能辅助诊断的精准性和敏感性。

2014年初至2018年底，我们在项目开展过程中，为了对颈动脉粥样硬化斑块进行有效的分析，需要获得高质量的数字病理扫描图像和分析软件。由此，我们在首都医科大学附属北京天坛医院先后分别联系并试用了多家数字病理扫描仪样机，比如：Zeiss、Leica、罗氏等，本文所展示的图片系Leica Aperio CS2扫描所获得。经试用后发现，不同厂家的数字病理扫描仪均能顺利地完成斑块切片全层面的数字病理扫描，也或多或少地匹配了一部分测量和分析功能。但是，在颈动脉粥样硬化斑块的辅助分析方面，目前均缺乏配套的、完善的分析软件。主要难点在于：（1）无法将颈动脉粥样硬化斑块连续切片的不同层面像MRI那样进行3D整合；（2）对于颈动脉粥样硬化斑块内的复杂成分，无法便利地划分和测量，比如测量脂质核、斑块内出血灶、钙化等的周长、面积、占比等。如果数字病理扫描仪配套的分析软件能够及时地跟上仪器硬件的发展，将有助于颈动脉粥样硬化斑块组织学分析工作的推进。