血、尿Smad2和TGF-β1与IgA肾病尿蛋白及内生肌酐清除率之间关系的研究

任 荣，莫 颖，张 静，张 艳

（新疆医科大学第五附属医院肾病科，新疆 乌鲁木齐830011）

IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）是目前最常见的一种肾小球疾病，影响到1%以上的普通人群，IgAN病程多呈缓慢进展，研究显示该病占原发性肾小球疾病的26.0% ～42.0%［1-4］其中15% ～40%的患者最终进入终末期肾病。TGF-β1/Smad信号通路过度活化是导致肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞发生转分化、肾脏纤维化发生发展的重要机制［5-7］。近期临床研究显示儿童IgA肾病尿TGF-β1水平是评价IgAN组织学损害程度和预后的重要指标［8］。但是临床关于血、尿TGF-β1及其信号通路中重要的信号转导分子与IgA肾病患者尿蛋白之间的关系仍不十分明确。我们选择检测受体激活型Smad2联合TGF-β1作为肾脏TGF-β1/Smad信号活化状态间接评估指标，通过检测比较健康人群与IgAN患者血、尿Smad2、TGF-β1和尿蛋白定量水平，分析IgAN患者Smad2、TGF-β1与尿蛋白之间的关系。

材料和方法

1 研究对象

本研究IgA患者50例，均来自2015年1月至2017年1月在我院住院并经过肾脏病理检查确诊IgAN患者，其中男性29例，女性21例，年龄四分位数范围为25～65岁，年龄中位数43岁。IgAN病理诊断及病理严重程度评估，采用2009年IgAN Lee氏分级，Lee分级Ⅰ级2例，Ⅱ级14例，Ⅲ级20例，Ⅳ级9例，Ⅴ级5例。对照组50例，均为门诊或住院检查无肾脏疾病的健康人群，其中男性28例，女性22例，年龄四分位数范围为20～60岁，年龄中位数40岁。两组在年龄性别分布差异无统计学意义。排除标准：IgAN组排除系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、感染急性期、肿瘤、过敏性紫癜等疾病导致的肾脏疾病；排除薄基底膜肾病；排除CKD5期或开始血液净化治疗的患者；对照组排除有肾脏疾病和患有各种自身免疫性疾病、感染急性期、肿瘤、过敏性紫癜等疾病的患者以及孕、产妇，并排除糖尿病、高血压病及冠心病患者。

2 标本的采集

IgAN组于入院后第2天清晨空腹抽取肘前静脉血3mL，所有血标本经3000 r/min离心20min后，收集血清置于-20℃冰箱内保存；并留取清洁中段晨尿10mL，置于普通试管内，置于-20℃冰箱内保存；并留取两组人员24 h尿液，记录24 h尿量，混匀后取10mL，置于-80℃冰箱内保存；做尿常规时均经3000 r/min离心20 min后，仔细收集沉渣液0.5mL进行检验。IgAN组患者均在未治疗前留取血液、尿液标本。对照组者于清晨空腹抽取肘前静脉血3 mL，并留取清洁中段晨尿，24 h尿液，采集方法同前。本研究获得我院医学伦理委员会批准和患者或其家属知情同意。

3 标本的检测

血尿蛋白采用免疫比浊法进行检测，血肌酐采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测，Smad2、TGF-β1采用Western blot方法进行检测。其中免疫比浊和ELISA全部操作按照试剂盒说明书进行，血尿蛋白试剂盒购于R&D System公司，ELISA试剂盒购于绍兴美迪康生物技术公司。

Western blot法操作如下：根据样品数量，将BCA试剂（凯基，货号：KGDBCA）A与试剂B按体积比为50∶1配制成BCA工作液，充分混匀后各孔加入160μL；把酶标板放在振荡器上振荡30s，37℃放置30 min，然后在562nm下测定吸光度，计算蛋白浓度。根据测定的蛋白质浓度，每孔加入20μL蛋白（必要时加大上样量），加入适量上样缓冲液，沸水浴10 min后离心取上清上样。制备PAGE胶，放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔。再用加样枪慢慢将样品加到对应的孔内。浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行转膜。在转膜装置上从负极到正极放置垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、垫片，除去气泡。恒流350mA，40min左右。2%的丽春红贮备液1：10稀释，检测转膜是否成功。并用甲醇再活化PVDF膜，TBST洗后进行封闭。使用5%脱脂奶粉（检测磷酸化蛋白用BSA）封闭膜。一抗加入封闭液中稀释到所需浓度和膜孵育4℃孵育过夜封闭。用TBST洗涤封闭的膜3次，每次5min，按照1：1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h，再用TBST洗涤3次，最后用一体式化学发光仪拍摄照片。

4 CCR计算公式

体表面积（m2）＝0.0061×身高（cm）+0.0124×体重（kg）-0.0099。

注：内生肌酐清除率为矫正值

5 统计学处理

采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两独立样本比较采用独立样本t检验；相关分析用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组患者血肌酐、尿蛋白定量、CCR比较

如表1所示：IgAN组与对照组相比，24 h尿蛋白、血肌酐水平均高于对照组，CCR低于对照组，出现肾功能轻度损伤（P均＜0.01）。

表1 两组患者生化指标比较（±s）

表1 两组患者生化指标比较（±s）

指标 对照组 IgAN组 t值 P值尿蛋白定量（mg/24h） 67.75±15.73 943.13±519.22 -11.916 0.001血肌酐（μmol/L） 79.18±12.02 114.22±24.34 -9.125 0.001 CCR（mL/min·1.73m2）95.34±8.74 74.49±17.55 7.521 0.001

2 两组患者血尿Smad2及TGF-β1表达比较

如表2所示，血尿Smad2及TGF-β1蛋白较IgAN组均明显降低，以尿指标减少最明显。

表2 血尿Smad2及TGF-β1蛋白相对灰度值比较（±s）

表2 血尿Smad2及TGF-β1蛋白相对灰度值比较（±s）

项目 对照组 IgAN组 t值 P值血Smad2 0.095±0.013 0.186±0.014 -5.412 0.001血TGF-β1 0.067±0.014 0.22±0.012 -6.195 0.001尿Smad2 0.002±0.001 0.029±0.008 -9.552 0.001尿TGF-β1 0.013±0.003 0.044±0.005 -7.423 0.001

3 两组患者血尿Smad2、TGF-β1与尿蛋白定量及CCR的相关性分析

相关性分析结果显示：尿液Smad2、TGF-β1与尿蛋白定量之间的存在一定正相关性（r分别为0.351，0.474，P＜0.05）。但血清Smad2、TGF-β1与尿蛋白定量无明显相关性（P＞0.05），血尿Smad2、TGF-β1与CCR也无明显相关性（P＞0.05）。

表3 各检验指标相关性分析结果

讨 论

大量研究证实，IgAN 肾组织中TGF-β1及Smad2、Smad3、Smad7水平表达增高，与肾脏纤维化密切相关［9-12］。相关研究［13-15］结果表明，IgAN患者血和尿TGF-β1水平均随病理分级加重呈递增趋势，同时TGF-β1/Smads信号通路中R-Smads与I-Smads的平衡水平的监测可能对预测IgAN患者的预后有重要意义［15］也有文献［5］提出IgAN肾组织及尿液TGF-β1、Smad7表达增高提示TGF-β1/Smad信号通路的过度活化。信号分子Smad7为抑制型信号分子（I-Samds），其主要作用为抑制其信号通路活性。但其他继发性或原发性大鼠肾间质纤维化的模型中检测结果中Smad7水平变化与该信号通路呈相反表现［16-18］，因此，认为Smad7增高反映TGF-β1/Smad信号通路过度活化是有一定争议的。Smad2属于受体激活型Smads，其与TGF-β1同时表达增高，则支持提示TGF-β1/Smad信号通路的过度活化。

本研究观察到IgAN患者血尿Smad2及TGF-β1水平均较健康人群升高。但只有尿Smad2、TGF-β1与尿蛋白定量之间的存在一定正相关性。我们推测IgAN患者尿Smad2及TGF-β1增高可能来源于肾组织同名指标分泌增多从尿液排出增多。虽然尚未检索到关于血尿Smad2与IgAN患者肾组织TGF-β信号通路相关文献。但尿液TGF-β1表达结果与其他相关肾脏病尿液报道结论一致，因此，上述尿指标增高可间接反映对TGF-β1/Smad信号通路活化状态。我们前期IgAN大鼠模型研究中观察到，IgAN大鼠尿液及肾组织Smad2、TGF-β1表达一致增高，且随着肾组织水肿及间质纤维化加重，表达增加更明显。这也支持今天人体试验观察推测。也有学者在IgAN患者肾组织中检测出Smad2 mRNA与TGF-β1表达异常增高，并参与Ⅳ型胶原过度表达和肾组织纤维化［19］。这支持我们的实验结果，也是对本实验结果机制的进一步解释。

虽然本研究血清Smad2、TGF-β1结果在两组之间存在差异，但无相关性，结合相关研究结果考虑血清学Smad2、TGF-β1指标影响较多，难以对混杂因素进行处理。因此血清学指标变化难以反映肾组织信号通路的活性，缺少临床价值。

综上所述，相比血清指标，尿液Smad2、TGF-β1更能间接反应肾脏TGF-β1/Smad信号活性状态，对于无创手段间接判断肾脏损伤有一定临床价值。