乌斯乃替代品、易混淆品HPLC 鉴别

潘 兰, 石明辉, 夏提古丽·阿不利孜, 贾新岳

(新疆维吾尔自治区中药民族药研究所,新疆乌鲁木齐830002)

维吾尔药乌斯乃为松萝科松萝属植物节松萝Usnea diffracta Vain.的干燥全草,性平和,具有收敛营养力、消散淤结、爽身强心、调经助阳的功效,用于久泻、久咳、心悸气短、癫痫、神失、心烦阳弱、呕恶气喘、月事不调、毒蛇咬伤［1］。前期课题组在市场调查中发现,乌斯乃使用的药材各异,来源复杂,作为《中华人民共和国卫生部药品标准 维吾尔药分册》 收载品种,标准中仅有“理化鉴别” 项［2］,难以判断药材的真伪,保证其入药的准确性及临床的有效性。

本研究对乌斯乃的市场流通及临床应用情况进行调查,并建立乌斯乃及其替代品、易混淆品的HPLC 鉴别方法。该方法快速、简便、专属性强,可为该药材的准确、安全使用及质量标准的提升提供数据支持。

1 材料

乌斯乃及其替代品、易混淆品(图1) 收集于新疆和田维吾尔市场、甘肃药材市场,经中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室郭守玉研究员鉴定,凭证标本存放于新疆维吾尔自治区中药民族药研究所。

松萝酸、黑茶渍素为实验室自制 (结构经1H-NMR、13C-NMR、MS 等波谱技术鉴定),HPLC 法测定其含有量均大于99%。微孔滤膜(0.22 μm,天津市津腾实验设备有限公司)。HPLC 所用试剂均为色谱纯；水为超纯水。

Waters2695 高效液相色谱仪 (美国Waters 公司)；PDA2998 检测器(美国Waters 公司)；Shimpack PREP-ODS(HKIT) C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本岛津公司)；AB265-S 电子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200DB 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 市场流通使用情况了解 走访调查,以及对资深专业人士的访谈。

2.2 HPLC 鉴别

2.2.1 色谱条件 Shimpack PREP-ODS(HKIT)C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相甲醇-1%乙酸(79 ∶21)；柱温30 ℃；检测波长285 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.2.2 供试品溶液制备 取样品约0.1 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入乙酸乙酯50 mL,密塞,称定质量,超声(200 W、40 kHz) 提取40 min,取出,放冷,再称定质量,乙酸乙酯补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 HPLC 图谱建立 精密吸取各供试品溶液10 μL,注入高效液相色谱仪,在“2.2.1” 项色谱条件下进样。对不同供试品HPLC 色谱图的峰数、峰面积、相对保留时间等参数进行比较,优化图谱。

2.3 相似度分析 将样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 年A 版) ” 软件,分析相似度。

3 结果

3.1 乌斯乃替代品、易混淆品 课题组对各地维吾尔药材市场及维吾尔医院的调查发现,乌斯乃替代品、易混淆品常见的有梅衣属植物槽梅衣Parmelia sulcata,条衣属植物条衣Everniastrum cirrhatum、中华金丝Lethariella sinensis 和长松萝Usnea longissima。

3.1.1 槽梅衣［3］隶属于梅衣科梅衣属地衣,叶状,上表面矿灰色,有光泽,下表面黑色,具有假根,致密,富分枝；髓白色；分生孢子器不发达；子囊盘表面生,罕见。主要生长在岩石或树皮上,分布于新疆等地。

图1 各样品照片

3.1.2 条衣［4］隶属于梅衣科条衣属叶状地衣,上表面浅灰至灰色,下表面黑色；裂片边缘整齐,稍向内卷,有时成沟状,裂片深裂成条带状,形成二叉状分枝,髓白色,边缘常有纤毛或假根。主要生长在松树或其他灌木的枯枝上,分布于云南、河北等地。

3.1.3 中华金丝［5］梅衣科金丝属地衣,具有真菌和藻类共生形成的特殊复合生物,多年生,枯草黄至黄绿色；丝体呈圆柱形或扁圆形,丝状体表面呈网状棱脊,基部污白色,向上渐次赭黄或桔黄色,无光泽,稍卷曲,顶端渐尖,无粉芽,子囊盘及分生孢子器。主要生长在高海拔雪山地带的松树枯枝上,分布于西藏、云南、四川等地。

3.1.4 长松萝［6-7］松萝科松萝属枝状地衣,灰绿色,成线状,下垂,长可达100 cm。外皮粗松,中心坚密。子器稀少,皿状,生于枝的先端。主要生长在松树或其他树的树皮上,分布于东北、陕西、安徽、浙江、广东、云南、西藏等地。

3.2 HPLC 鉴别

3.2.1 方法学考察

3.2.1.1 空白试验 精密吸取空白溶液10 μL,注入高效液相色谱仪,结果表明空白不干扰测定。

3.2.1.2 精密度试验 同一供试品溶液在“2.2.1” 项色谱条件下连续进样7 次,测得主要色谱峰面积及保留时间RSD 为0.30%,表明仪器精密度良好。

3.2.1.3 重复性试验 取同批药材6 份,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2.1” 项色谱条件下进样,测得主要色谱峰面积及保留时间RSD 为0.96%,表明该方法重复性良好。

3.2.1.4 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于0、1、2、4、6、12、24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样,测得主要色谱峰面积及保留时间RSD 为0.47%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.2.2 HPLC 特征图谱比较 乌斯乃及其替代品、易混淆品的HPLC 图谱见图2,包括色谱峰数、相对保留时间、色谱峰峰面积及比例,可直观地发现乌斯乃及其替代品、易混淆品上述指标差异很大。以乌斯乃正品为对照,利用相似度软件进行分析,发现替代品、易混淆品与其相似度很低,条衣、 中华金丝、 槽梅衣、 长松萝分别为0.003、0.004、0.003、0.001。

由HPLC 色谱图可知,在30 min 内条衣有16 个特征色谱峰, 其中易于辨识的有9 个, 最具特征性的在11.263 min处,峰形大；中华金丝有7 个分离度较好的色谱峰, 18.620、 24.068 min 处为其特征峰, 黑茶渍素(24.068 min) 所占比例为59.90%；乌斯乃有10 个色谱峰,13.301、19.376、21.669 min 处为其特征峰,且三者含有量达90%；槽梅衣有9 个特征峰,主要集中于11 min前,其中5.208 min 处所占比例达80%；长松萝有9 个特征峰, 以10.934、 18.950 min (松萝酸) 为主, 两者占99.75%。

4 讨论与结论

课题组在甘肃、新疆、四川、东北等地的调查发现,乌斯乃野生资源非常少,仅在黑龙江红星林场中生长,蕴藏量极低。目前,药材市场上未见有节松萝出售,现新疆维吾尔医院及药材市场用的乌斯乃主要是槽梅衣和条衣。据《中华本草》 (维吾尔药卷) 记载,长松萝也是乌斯乃药材的来源之一,随着用药的规范化,新疆维吾尔药厂现在用的基本为该品种。中华金丝由于形态和节松萝有诸多的相似之处,一直误作为节松萝使用和出售,基于此,课题组发现乌斯乃用药问题存在相当长一段时间,直接影响了药物有效性和临床安全性,对于这些药物是否可以代替乌斯乃入药还需要进一步的证实。

图2 各样品HPLC 色谱图

乌斯乃常见替代品、易混淆品为梅衣属、松萝属植物,松萝属植物以缩酚类、二苯并呋喃类、蒽醌类等成分为主,但是均含有松萝酸［6］；梅衣属植物主要含有黑茶渍素、藻纹苔酸、protocetraric 等成分［8］；条衣属植物含有生物碱、皂苷、鞣质类［9］。金丝属植物主要含有一些色素类物质［10］(canarione、1,2-quinone derivatives、rubrocashmeriquinone、7-chlororubrocashmeriquinone、 7-chlorocanarione)。 由 此 可见,乌斯乃与其替代品、易混淆品化学成分的差异较大,因此可用HPLC 法进行鉴别。

本实验建立了乌斯乃HPLC 图谱,与市场上常用的替代品、混淆品相比,其共有峰数差异明显,表明化学成分存在较大区别,它们能否应用于临床还需进一步研究。

同时,该方法基线稳定,易于操作,重复性好,能有效地区分乌斯乃及其替代品、易混淆品,可为该药材的鉴别及质量控制提供参考依据。