松萝酸提取工艺的研究

钱 骅，赵伯涛，王笑咪

(南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042)

松萝(Usnea diffracta Vain.)子囊地衣纲、茶渍目、松萝科植物，属藻类和菌类共生结合成的大型地衣丝状体，其生长悬垂附着于松杉或其他树木的枝干上［1］。目前松萝主要作为药用和抗菌素的原料，其有效成分主要有松萝酸。松萝酸异名地衣酸，易溶于氯仿、丙酮、乙醇等溶剂中，难溶于水。松萝酸的钠盐为淡黄色丝针晶，溶于水［2］。

目前发现松萝酸只存在于地衣中，松萝酸具有抑菌，消炎，止痛活性，松萝酸钠外涂对实验性大鼠皮肤损伤有加速修复作用，故可用于治疗外伤、溃疡，烧伤等方面，甚至在某些方面，松萝酸钠的生理活性比松萝酸强［3］;松萝酸的左、右旋体的抗菌作用无大的差别，在食品中可作防腐剂应用;松萝酸还具有植物生长抑制剂活性，可使植物子叶组织中叶绿素及类胡萝卜素的含量下降，这种性质或许将来可为除草剂利用［4］。

目前松萝酸的制备主要有有机溶剂回流提取、渗漉法、超声波或微波提取后，再经过重结晶或硅胶柱层析纯化的方式，获得高纯度的松萝酸，再碱化得到松萝酸钠。

本实验利用松萝酸在碱性溶液中有较大溶解性的特点，探索用碱液或含碱乙醇提取松萝酸，比较了不同碱性物质和碱液浓度、乙醇浓度的影响，利用高效液相层析测定松萝酸的含量，以松萝酸得率为评价指标，进行碱水提取工艺优化选择，确定最佳提取工艺，结果整理如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

破茎松萝(Usnea diffracta Vain.)由吉林省抚松县药材公司提供。松萝酸对照品(HPLC测得含量为96.7875%)氢氧化钠、碳酸钠、乙醇、氯仿、苯、醋酸、石油醚、甲醇、正丁醇、乙酸、甲苯等均为分析纯。

TU－1800型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，高效液相色谱仪(安捷伦公司)。

1.2 方法

1.2.1 松萝酸的提取工艺

松萝粉碎——碱水/或碱醇——热回流(90℃，3 h)提取——趁热过滤——滤液——加1 mol/L盐酸酸化(调pH 2～3)——冰箱(4℃)静置过夜——沉淀析出——乙醇加热(70℃)溶解沉淀——再重结晶，得到松萝酸制品。

1.2.2 薄层层析

由文献配制6种展层剂:(1)氯仿∶苯∶冰醋酸(7∶2∶1)，(2)石油醚∶氯仿∶甲醇(2∶4∶1)，(3)正丁醇∶乙酸:水(4∶1∶1)，(4)氯仿∶苯∶甲醇(4∶4∶1)，(5)甲苯∶乙酸(200∶30)，(6)甲苯∶乙酸(200∶15)。将试样和松萝酸标样点于同一薄板、层析、比较。

1.2.3 结晶体熔点的测定

结晶体熔点的测定采用双浴式熔点测定装置。加热过程中，观察温度的上升和毛细管中样品的情况、记录始熔(样品开始塌落并有液相产生)和全熔(固体完全消失时)的温度。并观察在初熔前是否有萎缩或软化，放出气体以及其它分解现象。

1.2.4 紫外光谱测定

分别取松萝酸标准品、各样品溶液中结晶体适量，以一定量乙醇溶解后稀释成一定浓度，在200～400 nm波长范围内扫描，用紫外分光光度计测定结晶体的紫外光谱，并确定松萝酸乙醇溶液最大吸收波长。

通过紫外光谱检测得知，实验所得的黄色针状结晶体(松萝酸制品)有两个吸收峰在210、290 nm左右(图1)，与松萝酸标准品(图2)有相似的紫外吸收峰，且与文献报道一致。

图1 松萝酸标准品的紫外光谱检测

图2 黄色针状结晶体紫外光谱检测

1.2.5 HPLC测定松萝酸的含量

(1)提取:准确称取(5±0.1)g松萝干粉置于索氏提取器中，95%乙醇索氏提取6 h，至样液无色，减压回收溶剂，真空干燥得松萝酸粗品。

(2)精密称取干燥的松萝酸对照品(或样品)，用少量CHCl3溶解，并定容至100 mL容量瓶中。从中吸取1 mL稀释至10 mL，并用0.45 μm微膜滤器过滤，备用。

(3)测定:色谱条件采用Agilent ZORBAX－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈∶2.5%醋酸溶液(78∶22，pH 3.5);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:20 μL;检测波长:285 nm，在此色谱条件下，松萝酸峰的保留时间为6.2 min。

图3 松萝酸标准样品HPLC图谱

图4 松萝酸标准曲线

(4)标准曲线:以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得回归方程为，y=57.405x－96.838，相关系数 R2=0.9991，式中 x为松萝酸的浓度(μg/mL)，y为峰面积(mAU)。

2 结果与分析

2.1 破茎松萝中松萝酸含量

由1.2.5方法测定破茎松萝中松萝酸含量，结果见表1，破茎松萝中松萝酸含量为2.40%。

表1 破茎松萝中松萝酸含量的测定

2.2 松萝酸提取

2.2.1 碱水提取

称取粉碎的松萝原料50 g，按表2进行单因素实验，料液比1∶10和1∶8，90℃热水浴提取提取两次每次2 h，，滤液合并、酸化，由 1.2.1 得松萝酸产品。测定松萝酸的含量，结果见图6。

图6 NaOH浓度对松萝酸提取的影响

随着NaOH浓度递增，松萝酸产品得率有增加，当NaOH达到1.0%时，得率最大，为7.2%;松萝酸含量也是随着 NaOH浓度的增高而增大的，当NaOH浓度为1.5%时，含量最高，为 27.8，同时它的转化率［(即产品得率×松萝酸含量)/材料中松萝酸中的质量］也是最高的，为72.9%，故以碱水提取时，宜选择1.5%NaOH作为提取溶剂。

2.2.2 碱醇提取

如2.2.1 称取、料∶液比，回流提取，酸化，处理，结果见如表2。

表2 碱醇提取松萝酸条件

图7 Na2CO3浓度对松萝酸提取影响

图7是在相同的乙醇浓度(75%)下，不同浓度的Na2CO3浓度对松萝酸提取的影响，可看出，随着Na2CO3浓度的递增，松萝酸产品得率增加;产品中松萝酸含量最高的是1号处理，且含量随Na2CO3增加有下降趋势;而转化率高的是4号和3号，分别是86.2%和82.9%。综合考虑，宜选择3号处理，即75%乙醇+4%Na2CO3。

2.3 松萝酸的检测

2.3.1 定性测定

分别对松萝酸标样、1.5%NaOH 和 4%Na2CO3，75%乙醇提取，酸化所制得的松萝酸产品进行性能测定，如果如表3。比较1.2.2中6种展层剂，结果表明，以(6)甲苯:乙酸(200∶15)为展开剂时能使样品中的松萝酸得到很好地分离，且展开后黄色斑点清晰，无拖尾现象，故本实验以甲苯:乙酸(200∶15)为展层剂。

表3 松萝酸产品性能

由表3可知，松萝酸标产品(1)和(2)的Rf值与标样相同，熔程接近标样，且产品(1)熔程较产品(2)为短。

2.3.2 HPLC 法测定

分别以 1.5%NaOH液和 75%乙醇 +4%Na2CO3为松萝酸提取溶剂，按1.2.1 和 1.2.4 提取和测定，其HPLC图为分别为图8和9和表4。

表4 松萝酸产品性能

图8 1.5%NaOH提取所得产品HPLC

图9 75%乙醇+4%Na2CO3提取所得产品HPLC

3 小结

(1)碱水为溶剂提取松萝酸，以1.5%NaOH，料液比1∶10和1∶8，90 ℃提取2次(2+2 h)，松萝酸转化率最高，为72.9%，松萝酸产品得率为6.3%，产品中松萝酸含量为27.8%。

(2)含碱乙醇提取松萝酸，以75%乙醇+4%Na2CO3提取较好，松萝酸产品得率和含量分别为8.6%和23.7%，松萝酸转化率为82.9%。

［1］阿不都拉·阿巴斯，吴继农.新疆地衣［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1998.

［2］Moreno C，Nicola S.A review on usnic acid，an interesting c［J］.Naturwissenschaften，2002;89:137 – 146.

［3］木全章，丁靖凯.地衣化学成分的研究，抗菌物质一松萝酸［J］.云南植物研究，1975，(2):51 一56.

［3］王 丽，阿地里江·阿不都拉，孙 华.松萝酸研究进展［J］.生物技术通讯，2005，16(4):472－473.