不同疾病来源幽门螺杆菌对蒙古沙土鼠胃黏膜损伤影响

唐义东， 柳云恩， 朴 瑛

1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁沈阳110032；北部战区总医院

2.全军重症(战)创伤救治中心实验室；

3.肿瘤科，辽宁沈阳110016

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染人群中少数可发展为慢性胃炎和消化性溃疡，严重者甚至可发展为胃癌[1]。有研究显示，H.pylori不同的致病能力可能与其疾病来源和基因亚型有关[2]。蒙古沙土鼠(Mongolian gerbils，MGs)的腺胃结构和功能与人类相似，自发性胃炎的发生率极低，其可为H.pylori诱导的慢性活动性胃炎、胃癌的发展等研究提供了可用的动物模型[3]。几种天然产物如菜籽油、咖啡酸苯乙酯及蜂胶提取物等对H.pylori诱导的MGs相关性胃炎和胃癌有抑制作用[4]。此外，有研究发现，MGs感染溃疡分离株TN2GF4后会造成明显的炎症、溃疡及腺癌等病理改变，而MGs被溃疡分离株7.13感染14周后，近1/3的MGs发生高分化腺癌，18周后，将近半数的MGs发生高分化腺癌，其子代菌株B128仅能导致MGs发生轻度溃疡和胰腺炎[5-6]。本研究旨在探讨不同疾病来源H.pylori对MGs胃黏膜损伤的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 雄性SPF级MGs 30只，6周龄，购自浙江省医学科学院实验动物中心。动物饲养在室温(20℃ ±2℃)，相对湿度40% ～60%，12 h明暗循环的标准实验室环境。自由摄食、饮水。动物观察及适应环境7 d。不同疾病来源的H.pylori购自中国医科大学肿瘤研究所。

1.2 研究方法

1.2.1 实验动物分组及胃黏膜损伤模型建立 将30只MGs随机分为对照组、胃炎H.pylori组(胃炎株组)和胃癌 H.pylori组(胃癌株组)，每组各10只。胃炎株组和胃癌株组MGs禁食禁水12 h后，分别将含不同疾病来源H.pylori的生理盐水1.0 ×108CFU/ml灌胃 l ml，每日1 次，连续3 d，对照组仅灌生理盐水。接种H.pylori后禁食12 h，4 h后自由摄水，连续观察26周。

1.2.2 病理学检查 接种H.pylori后第26周，处死动物。处死前，MGs禁食禁水12 h，乙醚吸入麻醉，对动物胃黏膜进行观察。由前胃、腺胃至十二指肠纵向切成约1.0 cm×0.4 cm条块，然后将组织进行石蜡包埋，用于制作病理组织切片。

1.2.3 免疫印迹试验检测 采用免疫印迹试验检测胃黏膜组织核因子-红系2相关因子2(Nrf2)、Nqo1和Ho-1蛋白表达。将黏膜组织充分碾碎后，在冰上用溶解缓冲液处理45 min，然后将其在95℃下加热5 min，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳分离等量的蛋白质，移至聚偏二氟乙烯膜。将含有5%牛血清白蛋白的缓冲盐水和TBST阻断膜1 h后，加一抗孵育，4℃过夜，然后用TBST洗涤3次，加二抗培养2 h，使用增强化学发光试剂盒发光。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同疾病来源 H.pylori致 MGs胃黏膜病变 建模第26周，对照组胃黏膜未见任何大体改变；胃癌株组80%动物可见胃黏膜糜烂、溃疡，溃疡表现较大，直径约为10 mm，边缘显示不整，伴有黏膜出血，周围黏膜粗糙；胃炎株组40%动物胃黏膜可见糜烂、溃疡，溃疡直径较小，边缘整齐。见图1。

图1 不同疾病来源H.pylori致MGs胃黏膜大体病变

2.2 不同疾病来源H.pylori致MGs胃黏膜组织病理学改变 镜下可见，胃癌株组发生明显的炎症细胞浸润，黏膜糜烂、溃疡，肠黏膜化生等病理改变；而胃炎株组胃黏膜损伤程度较轻，仅见少量炎症细胞浸润，未见明显的黏膜萎缩改变。胃癌株组和胃炎株组导致黏膜炎症的发生率分别80%和40%，黏膜糜烂、溃疡的发生率分别为80%和35%，黏膜发生腺体萎缩、肠化生的概率分别为60%和5%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 不同疾病来源H.pylori致MGs胃黏膜组织病理学改变

2.3 不同疾病来源H.pylori致MGs胃黏膜Nrf2/Nox4通路蛋白表达 与对照组比较，胃炎株组和胃癌组黏膜Nrf2蛋白的表达增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与胃炎株组比较，胃癌株组Nrf2蛋白的表达增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表达降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

图3 不同疾病来源H.pylori致MGs胃黏膜Nrf2/Nox4通路蛋白表达

3 讨论

目前，关于H.pylori的持续定植和H.pylori相关胃炎在胃黏膜中的发展尚不清楚，但胃上皮细胞与H.pylori诱导的免疫反应间的相互作用是一个关键的促因。胃上皮细胞能使免疫细胞产生炎症反应[7]。本研究比较了胃癌及胃炎H.pylori分离株感染26周后，MGs胃黏膜的损伤程度。结果发现，第26周，感染胃癌分离株的MGs黏膜及黏膜下层出现明显的淋巴滤泡，糜烂、溃疡、腺体萎缩及肠化生等病变，而感染胃炎分离株则病变程度较轻，仅见轻度的炎症反应等病变。

有研究显示，H.pylori的定植密度与黏膜炎症的严重程度、炎细胞的浸润程度有关，而H.pylori的感染时间和定植密度可调节其致癌作用[8]。H.pylori定植密度及检出率随感染时间的延长而逐渐降低，不同疾病来源的菌株造成MGs损伤程度亦有不同[9]。胃癌分离株TK1402可造成MGs黏膜发生炎症、萎缩及肠化生等病变；而胃溃疡分株TN2GF4菌株虽然也会造成MGs黏膜发生急性胃炎和肠化生等改变，但更容易导致十二指肠炎，不同疾病来源的H.pylori在造成MGs胃黏膜损伤方面比较，差异有统计学意义(P＜0.05)[10-12]，与本研究结果相似。有研究显示，cagPAI＋H.pylori更倾向于诱导MGs黏膜产生溃疡、萎缩、肠化生及增生性病变[13-15]；而cagPAI-H.pylori易导致MGs发生糜烂和轻度炎症反应[16-17]。本研究中所采用的两种菌株均为cagPAI＋H.pylori菌株，但这两种菌株的致病性仍然存在较大差异。这提示，cagPAI＋可能只是决定H.pylori致病能力的因素之一。因此，不同疾病来源的H.pylori对MGs黏膜损伤是一个复杂、多因素、多步骤共同作用的结果，其某些关键基因的突变和缺失可能会在某种程度上降低其致病能力。Nrf2是含转录因子的碱性亮氨酸拉链，通过结合顺式作用的增强子序列调节一系列的基础和诱导表达，发挥细胞保护和抗氧化作用[18]。在静态条件下，Nrf2通过结合其抑制剂KEAP1而保留在细胞质中。如果该结合被破坏，Nrf2会转移至细胞核，并启动抗氧化基因的转录[19]。本研究发现，与对照组比较，胃炎株组和胃癌株组MGs黏膜Nrf2蛋白的表达增加，Nqo1和Ho-1蛋白的表达降低；与胃炎株组比较，胃癌株组Nrf2蛋白表达增加，Nqo1和Ho-1蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。这表明，不同疾病来源的H.pylori导致胃黏膜损伤差异可能与Nrf2/Ho-1通路相关。

综上所述，不同疾病来源的H.pylori对MGs胃黏膜的损伤有明显不同，胃癌来源的H.pylori对MGs胃黏膜的损伤能力更强，这种损伤差异可能与Nrf2/Ho-1通路的激活有关。胃癌分离H.pylori菌株致病能力的具体分子机制尚有待进一步研究。