银杏叶提取物治疗缺血性脑卒中的研究进展

袁露，李艺，徐志猛，闻晓东，李萍

（中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009）

银杏叶为银杏科植物银杏的叶，银杏叶提取物（extract ofGinkgo biloba，EGB）是从银杏叶中提取的多种药用成分的混合物，其主要活性成分为黄酮类、萜内酯类、有机酸类化合物等[1]。EGB具有抗氧化、抗炎、保护线粒体功能以及抑制细胞凋亡[2]等作用，在治疗脑卒中、心绞痛等心脑血管疾病方面具有显著疗效[3]，在临床上EGB已被制成各种中成药和中药注射剂，应用广泛。据不完全统计，国家药品监督管理局（NMPA）发布银杏类药品主要包括银杏叶口服制剂和银杏叶注射制剂，银杏叶口服制剂类产品包括银杏叶胶囊（片剂、颗粒、滴剂、滴丸、酊、口服液、软胶囊）、杏灵颗粒（胶囊、片剂、滴丸）、银杏酮酯滴丸、银杏蜜环口服液，银杏叶注射制剂包括注射用银杏叶提取物、杏丁注射液、银杏叶提取物注射液、舒血宁注射液。

脑卒中（cerebral stroke）又称“中风”、“脑血管意外（cerebralvascular accident，CVA）”，是全球第二大致死死因，具有高发病率、高病残率和高病死率的特点[4]。作为一种急性脑血管疾病，脑卒中是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液进入大脑发生障碍，造成该血管供血区的脑组织缺血、缺氧而引起脑组织坏死、软化的一组疾病，包括缺血性和出血性脑卒中[5]。其中，缺血性脑卒中又称急性脑供血不足，占卒中患者总数的75% ~85%，临床上主要表现为进展性卒中、完全性卒中、可逆性神经功能障碍、短暂性脑缺血发作等几类。全球每年约有1 500万例缺血性脑卒中患者，脑卒中发病后，第1 d患者死亡率达到10% ~ 20%，5年内的生存率只有15% ~ 40%，且随着年龄增大或身体自主能力的减弱或丧失，死亡率明显升高，其中约30%患者死亡，30%患者永久性残疾，造成严重的社会经济负担，且其中80% ~ 85%缺血性脑卒中由脑血栓形成或脑梗死引起[6-7]。缺血性脑卒中给患者的躯体功能、心理健康乃至社会生活能力等诸多方面都带来严重损害，逐步成为研究热点。本综述结合近年来发表的文献，总结了缺血性脑卒中的主要发病机制及其常用的治疗药物。其中，重点针对EGB对抗缺血性脑卒中的化学成分及其药理活性研究作了深入探讨，以期为缺血性脑卒中的预防和诊治提供有益的借鉴。

1 缺血性脑卒中的主要发病机制及病理反应

缺血性脑卒中主要由脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄性闭塞和栓塞引起，前者是指动脉自身病变所致的管腔狭窄或闭塞，其表现形式主要是动脉粥样硬化，后者即为进入动脉的栓子随血流堵塞远端管径相对较小的动脉，包括动脉-动脉栓塞、心源性栓塞、空气栓塞等。其主要发病机制如下：由脑内动脉闭塞引发的脑缺血带来缺血半暗区血流量、血小板活性以及纤溶活性的改变，进而引发兴奋性氨基酸毒性作用、自由基损伤、炎性反应及相关凋亡基因的表达等一系列的病理反应，导致缺血区域核心内立即发生不可逆转的坏死，在接下来的几小时或几天内，这种明确的病变会显著扩大，引起功能的进一步丧失，以下详细阐述其病理反应。

1.1 兴奋性氨基酸毒性作用

兴奋性氨基酸以谷氨酸（Glu）和天门冬氨酸（Asp）为主，Glu作为不能通过血脑屏障的非必需氨基酸之一，在脑内含量最丰富，Glu必须由葡萄糖和其他前体经不同化学途径在脑内合成。Glu的兴奋性毒性是缺血性脑卒中级联损伤反应如自由基过度形成、细胞凋亡因子的表达、炎性反应的初始诱因。在缺血性脑卒中发作时，氧气、营养物质供应的中断导致神经元发生去极化，小胶质细胞及星形胶质细胞释放大量Glu到细胞外空间[8]，由于Glu的摄取是一个高能量依赖性过程，因此在Glu的稳态平衡遭到破坏时，会产生Glu的兴奋性毒性，进一步触发神经元的死亡。

1.2 自由基损伤

自由基是机体正常代谢产物，具有积极的防御作用；同时，它还具有高度的活泼性和极强的氧化反应能力，当机体积聚过多时会导致机体的组织破坏和退行性变化。脑组织内含有大量的不饱和脂肪酸，极易发生氧化还原反应，然而脑组织内抗过氧化及清除自由基的能力明显低于其他组织，因此自由基的大量堆积也是引发缺血性脑卒中的重要因素之一[9]。此外，活性氧（reactive oxygen，ROS）的爆发还会造成脑组织细胞的损伤，并且引起染色体畸变、DNA链断裂或者碱基改变破坏DNA，从而改变蛋白质结构，破坏脑组织结构与功能[10]。

1.3 炎性反应

炎性因子作为免疫反应的基本介质，由中枢神经系统（central nervous system，CNS）产生，参与细胞炎性浸润。在缺血性脑卒中病理机制的发展过程中，由局部缺血引起的细胞坏死、细胞凋亡碎片和增加的ROS能激活常驻小胶质细胞和星形胶质细胞以及来自血液循环中的浸润性白细胞引发神经炎性反应，从脑和外周募集的免疫细胞进入缺血组织后，通过一系列的反应来进一步加剧脑部梗死[11]。研究证明Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）家族是诱导炎性介质产生的重要因素，TLR家族成员包括 TLR3、TLR4、TLR8、TLR9等多种 TLRs。在缺血性脑卒中的发生发展过程中，神经元细胞的TLR8信号被激活以响应脑损伤，并通过激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路导致细胞凋亡，加剧脑损伤。同时，受损神经元释放的过氧化物还原酶能够与小胶质细胞的TLR4结合，增加髓样分化因子（MyD88）和核因子κB（nuclear factor kappa B predominate，NF-κB）的表达，促进白细胞介素IL-1β和IL-6的释放，激活小胶质细胞[12]。此外，在缺血、缺氧等外界因素的不断刺激下，小胶质细胞被过度激活转化成吞噬细胞，释放对细胞有毒性的物质参与炎性反应，破坏血脑屏障，加重脑水肿，最终造成组织坏死[13-14]。

1.4 相关凋亡基因的表达

细胞凋亡是脑缺血再灌注过程中神经细胞的主要死亡形式[15]。脑缺血、谷氨酸兴奋性毒性、能量代谢障碍、细胞毒素、自由基损伤及炎性反应等是神经细胞凋亡的细胞外调控因素；而细胞内调控因素则以Caspase酶与Bcl-2蛋白家族为主。Caspase-3作为一种半胱氨酸蛋白酶，是参与细胞凋亡的主要蛋白酶，也是细胞外部和内部凋亡途径共有的效应分子。在缺血性脑卒中的病理进程中，Caspase-3通过降解细胞中相应的底物来激活凋亡通路，从而导致细胞凋亡。研究表明在局灶性脑缺血再灌注发作后早期局部给药，Caspase-3介导的细胞凋亡水平会显著降低，并能促进缺血性脑卒中后神经元再生和恢复能力显著增加[16]。Bcl-2蛋白家族主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bak、Bax等，当细胞中Bax过表达时，其二聚体的数量急剧增加，促进细胞凋亡；当Bcl-2高表达时，Bax二聚体解离，成为Bcl-2和Bax的稳定复合物，能延长细胞寿命[17-18]。因此，Bcl-2/Bax的比率大小对于细胞结构和功能具有重要的调节作用。研究发现：大鼠脑缺血再灌注模型中，Bax表达上调而Bcl-2表达下调，且Caspase-3凋亡信号通路激活，最终导致神经元细胞凋亡[19]。

2 缺血性脑卒中常用的治疗药物及优缺点

在缺血性脑卒中临床治疗中，通常将西医的急救治疗与中医辨证施治的理念相结合，这充分利用了中药多成分、多靶点的组成和作用特点，显著提高了患者的生活质量[20]。西医治疗中通过抗血小板聚集、溶栓、抗凝、降纤、扩容等手段改善脑部血液循环以及保护神经、血管支架形成术、机械取栓等相关治疗来缓解缺血性脑卒中患者的病情变化[21]。中药治疗缺血性脑卒中多集中于术后患者的恢复和预防复发等，药物种类较多，包括中药注射剂、传统中药方剂、口服中成药等，临床报道均有显著疗效[22]。针对不同时期的缺血性脑卒中患者给予不同的药物制剂或中药复方，能够获得更好的治疗效果。

治疗缺血性脑卒中的常用药物包括预防脑卒中的抗血小板药阿司匹林、早期溶栓药物组织性纤溶酶原激活剂（t-PA）、中期钙拮抗剂尼莫地平以及治疗缺血性脑卒中恢复期和后遗症的银杏叶制剂EGb761，上述药物治疗缺血性脑卒中的优缺点见表1。EGB能够从拮抗血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、抗炎抗氧化、改善脑缺血缺氧导致的能量代谢紊乱和谷氨酸中毒等多个方面来保护脑细胞和恢复神经功能，现已在临床上被广泛应用于缺血性脑卒中的预防和治疗，并取得了显著的疗效。

表 1 治疗缺血性脑卒中常用药物优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of typical therapeutic drugs for ischemic stroke

3 银杏叶提取物对抗缺血性脑卒中的化学成分

目前标准的EGB是按照德国Schwabe专利工艺生产的EGb761，含有24%的黄酮苷和6%的萜内酯（2.8% ~ 3.4%的银杏内酯A、B、C及2.6% ~ 3.2%的白果内酯）以及小于5 µg · g-1的银杏酸。EGB中含有大量的药用化学成分，黄酮类、萜内酯类以及有机酸类成分对缺血性脑卒中具有显著的神经保护作用[34]。

3.1 黄酮类

黄酮类化合物泛指2个苯环通过中央三碳原子相互连接而成的一类化合物的总称，它们都含有C15核。迄今已从EGB中鉴定出的黄酮类化合物有70多种[35]，根据分子结构差异，分为黄酮、黄酮醇及其苷、双黄酮等几大类，其中黄酮醇（苷）是主要的活性成分[36]。黄酮类化合物在缺血性脑卒中发病过程中，通过清除脂质过氧化自由基、羟基、一氧化氮（NO）及O2-等来抑制丙二醛等毒性物质的产生，以及氧自由基反应与脂质过氧化反应，进而发挥活性作用[37]。

3.2 萜内酯类

萜内酯类化合物是EGB中另一类重要的生物活性物质，目前已分离出的萜内酯类化合物依据其结构可分为二萜类化合物银杏内酯和倍半萜类化合物白果内酯，其中银杏内酯包括银杏内酯A、B、C、M、J、K、L。银杏内酯注射液中主要成分银杏内酯通过干扰血小板依赖性血栓的形成、改善脑及外周血液循环、抑制血小板聚集等多种途径发挥抗PAF效应。

3.3 有机酸类

EGB中主要含有对香豆酸、原儿茶酸、香草酸、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、莽草酸等多种有机酸化学成分。EGB中的有机酸大多为水溶性羧酸类化合物，具有不同程度的神经保护作用。以对香豆酸为例，作为一种神经保护剂，具有强抗氧化和抗凋亡的特点，实验表明对香豆酸预处理脑缺血再灌注小鼠可改善其脑氧化应激、脑梗死和神经损伤症状[38-39]。

4 银杏叶提取物保护缺血性脑卒中的药理研究

4.1 保护缺血性脑卒中的药理活性

4.1.1 抗氧化作用 抗氧化特性是EGB常见的表观现象之一，其主要通过调节氧化应激、清除自由基和抗脂质过氧化损伤这3个方面发挥抗氧化作用。Zhou等[40]检测了大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）动物模型脑组织中谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和NO的水平，结果发现：EGb761能增加谷胱甘肽过氧化物酶和SOD的水平，降低丙二醛和NO的水平，从而抑制氧化应激，对抗缺血性脑卒中损伤。Kwon等[41]报道，EGB可以降低锌诱导的大鼠原代皮质神经元细胞内ROS水平。在MCAO小鼠模型的不同组织中也报道了与上述研究类似的结果[42-43]。Pietri等[44]发现：在心肌缺血缺氧时，EGb761能促进SOD活性发挥，抑制自由基产生。Ye等[45]在体内研究中明确EGb761能减少MCAO大鼠中ROS的堆积。生物体内细胞的正常结构和生理功能受到累积过氧化脂质的损害，而多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）具有强氧化损伤敏感性，EGb761可以增加红细胞膜中循环PUFA的水平，从而增强成年雄性Wistar大鼠的抗氧化损伤能力[46]。另外，EGB中的槲皮素发挥作用的途径如下：阻断清除氧自由基的过程来终止自由基连锁反应链，减少对不饱和脂肪酸的破坏，进一步降低氧自由基和脂质过氧化反应导致的病理性损伤[47]。

4.1.2 抗血小板活化因子作用 PAF是由炎性细胞、血管内皮细胞和血小板等多种细胞产生的一种内源性磷酯，属于强效血小板聚集诱导激活剂之一。EGB能够减轻PAF引起的血小板聚集，从而减轻脑缺血损伤，其中银杏内酯B抗PAF活性最好。EGB的主要成分银杏内酯既是高度专属性的PAF受体阻断剂，也是具有临床应用前景的天然PAF受体阻断剂，其分子机制是通过作用于靶细胞膜受体，发挥竞争性作用，抑制PAF与其受体结合，从而减轻细胞毒性，修复脑组织结构与功能。研究发现：PAF的活化能加重MCAO模型引起的脑神经元损伤，而EGb761能抑制PAF活性，保护脑缺血损伤[48]。

4.1.3 保护线粒体功能 线粒体是神经元主要的细胞器，通过氧化磷酸化或线粒体呼吸链产生能量，被称为细胞的“动力工厂”，对调节细胞功能至关重要。研究表明，线粒体功能障碍会引发ROS的大量释放，诱导氧化应激，导致线粒体结构破坏及功能受损，引起神经元细胞凋亡和组织损伤[49]。EGB中的内酯类成分银杏内酯B能增强线粒体氧化呼吸链中复合体Ⅰ和Ⅳ的活性，加强氧化磷酸化[50]，发挥保护线粒体功能的作用。

综上，EGB通过抗氧化、抗PAF以及保护线粒体结构与功能的作用，减少缺血性脑卒中导致的神经损伤。此外，EGB还具有抗炎、抑制细胞凋亡等药理作用。

4.2 保护缺血性脑卒中的相关信号通路

4.2.1 促分裂原活化蛋白激酶信号通路 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路的基本组成包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，这三级激酶主要负责MAPK级联反应中特定组分的活化。MAPK家族中细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK）、JNK或应激活化蛋白激酶（SAPK）和p38通过激活不同的效应途径来完成对MAPK信号通路的调节，组成3条并行的MAPKs信号通路。当受到外界刺激的时候，这些激酶被苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化作用激活，激活的MAPK主要通过调控细胞内酶、转录因子、细胞溶质蛋白、炎性介质的产生和细胞凋亡来发挥作用[51-52]。在局灶性MCAO动物模型中，MAPK信号通路被激活，在调节神经元结构及功能的过程中发挥关键作用[53-56]。缺血性脑卒中发生后，通过抑制p38信号通路，减轻缺血引起的线粒体破碎，从而修复脑梗死面积和神经功能缺陷[57]。在对miRNA-26a的研究过程中发现，激活MAPK/ERK信号通路能够促进大鼠脑梗死后的血管生成，为缺血性脑卒中提供新的治疗靶点[58]。

在缺血性脑卒中部分MAPKs的激活会加速缺血后神经元凋亡，MAPK家族的成员如JNK、p38，已经被证实参与了缺血性脑卒中引起的神经损伤级联反应[59]。JNK和p38是细胞调亡的媒介物，缺血后都被促炎性细胞因子激活，在脑部缺血敏感区域也出现JNK和p38的激活损伤。EGB对MCAO神经保护作用的相关研究表明，EGB中的白果内酯能够减少NO、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和IL-1β的产生以及抑制JNK1/2和p38炎症信号通路[60]。研究结果表明，在MCAO大鼠中缺血半暗带ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的磷酸化作用明显增加，白果内酯通过抑制JNK1/2和p38对MAPK信号通路的活化来发挥神经保护作用[61]。此外，银杏内酯能通过阻断p38磷酸化进一步抑制血小板功能[62]，也能通过p42/p44 MAPK信号通路的激活来发挥保护PC12多巴胺神经元的作用[63]。

4.2.2 磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B信号通路磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路参与许多细胞过程，包括细胞凋亡、存活和增殖[64-65]。在一系列上游或旁路信号分子的影响下，PI3K扮演着将胞外信号传递与细胞应答效应衔接起来的角色，作用于下游的信号分子。Akt即丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K信号传导途径中的主要下游靶标，PI3K可使Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化。Akt作为一种关键信息分子，可促进细胞存活，抑制细胞凋亡并维持正常功能[66]。研究发现EGb761能够通过激活Akt信号通路来抑制神经元凋亡[67]。活化的Akt可以向下游底物传输信号，常见的下游蛋白包括TSC1/2-Rheb-mTOR[68]、促凋亡因子JNK、NF-κB和正常转录因子FKHR[69]。研究表明PI3K-Akt-mTOR/JNK信号通路在缺血性脑卒中中起主要作用[64,68,70-71]。此外，研究发现缺血性脑卒中发作后，脑动脉局部血流的中断可激活Akt信号通路，抑制神经细胞凋亡并促进细胞存活，mTOR通路的激活促进神经元存活和轴突再生[72-76]。

在缺血性脑卒中发展过程中，激活的Akt诱导下游蛋白的磷酸化表达，如核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），保护细胞免受缺血性损伤。作为核转录因子的CREB通过磷酸化Ser133而被Akt激活，促进CREB结合蛋白易位至启动子并触发保护性蛋白的表达[77-80]。MCAO小鼠被给予EGB后，其海马区p-Akt和CREB蛋白表达明显增加，神经元数量明显增多。因此，研究推测EGB通过激活Akt/CREB信号通路来发挥神经元保护作用[8]。Nrf2通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用调节各种抗氧化蛋白的转录和表达，ARE是最重要的内源性抗氧化应激途径之一[81]。研究表明，Nrf2抗氧化应答途径可以保护大脑免受缺血再灌注损伤，发挥抗脑缺血再灌注损伤作用[82]。此外，Nrf2激活剂已被证明通过保护内皮细胞和周细胞并上调紧密连接蛋白的表达来改善局灶性脑缺血中的血液转化[83]。Akt/Nrf2和Akt/CREB信号通路的调节是治疗缺血性脑卒中的有效途径之一。与此同时，研究表明，二萜银杏内酯葡甲胺注射液通过激活PI3K/Akt介导的Nrf2和CREB信号通路来改善大鼠缺血再灌注损伤，其主要成分银杏内酯A、B和C均能在缺血性损伤中发挥神经保护作用，故银杏内酯相关制剂可能成为治疗缺血性脑损伤的有效药物之一[82]。此外，细胞凋亡和自噬是目前缺血性脑卒中介导脑损伤的较为明确的机制[84-85]，在MCAO大鼠模型中，EGB中的白果内酯B能够通过激活Akt信号通路增加血管生成、抑制细胞凋亡和自噬从而发挥其神经保护作用[86]。

4.2.3 LCN2-JAK2/STAT3信号通路 LCN2-JAK2/STAT3信号通路在细胞的增殖、分化以及免疫调节等生物过程中起重要的作用[87]。LCN2是分泌型脂质运载蛋白家族的成员，已有研究证实LCN2能诱发缺血性脑卒中[88-89]。临床试验发现LCN2是介导脑缺血和其他病理情况下的神经炎症的关键组分[90-91]。JAK-STAT信号通路在细胞造血[92]、免疫应答[93]、细胞稳态[94]、星形胶质细胞增生[95-96]以及抑制神经胶质瘤恶化[97]中发挥重要作用。

CNS受到损伤后，Tyr705磷酸化能够引起STAT3活化增加[98-99]。越来越多的证据表明JAK2/STAT3信号通路在缺血性脑卒中诱导的血管生成中起主要作用[100-101]。STAT3的激活与缺血性脑卒中中神经炎症的增加相关[102]，其中JAK2-STAT3信号通路不仅参与LCN2诱导的CXCL10分泌，而且可能参与星形胶质细胞增殖相关的其他表型改变[103]。在Zhang等[2]的研究中，运用糖氧剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）模拟脑缺血病症的体内和体外模型，星形胶质细胞中p-STAT3和p-JAK2蛋白水平均上调。然而，EGB在MCAO小鼠模型和OGD诱导活化的星形胶质细胞中，可通过促进抗炎有效地抑制JAK-STAT信号通路，保护脑组织。另外，LCN2过表达能增加p-STAT3和p-JAK2的表达，但是EGB能逆转这些变化。因此，研究者推断EGB通过抑制LCN2信号通路来抑制星形胶质细胞中STAT3和JAK2的磷酸化，减轻神经炎症，从而介导EGB的神经保护作用。近期的研究发现，银杏内酯K通过介导JAK2/STAT3信号通路中VEGF表达，促进血管生成，缓解缺血性脑卒中带来的脑损伤[104]。4.2.4 小结 在缺血性脑卒中发展过程中，脑组织中ROS的产生与清除平衡被打破，局部产生的ROS的浓度升高，通过与DNA、细胞膜、蛋白质以及其他分子之间的反应来激活MAPK及PI3K-Akt信号通路，亦可引起脂质的过氧化来激活LCN2-JAK2/STAT3信号通路，MAPKs的激活可通过JNK、p38、ERK这3条转导通路引发一系列的反应造成损伤，PI3K-Akt及LCN2-JAK2/STAT3信号通路的激活同样与脑损伤紧密相关。EGB能够作用于MAPK、PI3K-Akt及 LCN2-JAK2/STAT3这3条信号通路来发挥神经保护作用，这3条信号通路并不能阐明EGB在缺血性脑卒中中发挥神经保护作用的所有机制，还有更多的作用机制亟待我们深入研究。

5 结语

本文通过对EGB在缺血性脑卒中中发挥神经保护作用的药用成分及其药理作用的探讨，期望读者对EGB在缺血性脑卒中中的表观现象及其参与神经保护作用的相关信号通路能有更深入的认识。EGB作为中药提取物，具有多成分、多靶点、多机制的药物特点。随着对其作用机制的深入研究，可以相信，研究人员将会找到更多药物作用靶点和信号通路，从而为缺血性脑卒中的治疗提供更多的新思路。