间充质干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究进展

徐轶冰，陈应城，岑国欣*

（1. 南京艾尔普再生医学科技有限公司，江苏 南京 211100；2. 香港大学李嘉诚医学院生物医学学院，香港）

中枢神经系统疾病一旦造成神经细胞的大量凋亡，将导致身体功能的丧失、生活质量的下降，甚至寿命缩短。这些疾病，包括脑卒中[1]、创伤性脑损伤（TBI）[2-3]、脑白质疾病（WMD）[4]等，由于成因较复杂，加上中枢神经系统的自我修复能力有限，至今仍缺乏有效治疗手段。间充质干细胞（MSC）是一种成体干细胞，可从骨髓、脂肪、脐带及脐血等不同来源获得，而不同来源的MSC在功能上也可能存在差异[5]。MSC的治疗机制可划分为直接修复和间接修复2种：直接修复即MSC分化为具有特定功能的细胞并直接参与组织的修复再生；间接修复的机制主要包括分泌促进组织再生的因子、细胞物质的输送及交换以及通过免疫调控减轻炎症，从而达到组织修复的目的[6]。MSC的另一优势是具有一定的归巢能力，例如通过晚期激活抗原4（very late antigen 4，VLA-4）/血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）等信号通路，MSC可较高效地迁移至受损组织并参与修复[7]。本文将对MSC的鉴定标准以及不同来源的MSC进行介绍，并集中探讨MSC治疗中枢神经系统疾病的研究进展。

1 间充质干细胞的鉴定

Dominici等[8]在2006年发表了MSC的基本鉴定标准，其受到广泛使用（见表1）。尽管该标准得到了业界较广泛的认可，MSC的鉴别仍有较多改善空间。首先，不同来源的MSC在不同状态下，标志物的表达存在差异，例如原代脂肪来源MSC为CD105阴性，但贴壁培养后为CD105阳性[9]，单纯使用Dominici等提供的标准则可能引起误判。MSC的分化潜能是另一问题，例如脐带来源MSC可分化为平滑肌细胞[10]，超出了Dominici等提到的“可在体外分化为造骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞”的标准，而骨髓来源MSC含有表达神经干细胞标志物Nestin的亚群体，并可分化为具有完整功能的神经胶质细胞[11]，促进神经组织的再生[12]，可见单纯使用该标准将对不同来源人MSC鉴别造成困难。未来的临床应用级别MSC的鉴别标准，首先应考虑来源所带来的MSC性质上的不同，然后针对各个来源的MSC分别设独立且更详细的标准，将MSC的鉴别分类细化。其次，应考虑MSC培养条件和时间对细胞造成的影响，设原代细胞鉴别标准和培养后细胞鉴别标准。最后，针对不同适应证应建立不同的鉴别/质量标准，例如用于治疗神经疾病的MSC，其Nestin阳性率需达一定百分比。

表1 间充质干细胞基本鉴定标准Table 1 Minimal criteria for the identification of MSCs

2 间充质干细胞的来源

MSC可从骨髓、脂肪、脐带、脐血、胎盘等组织或来源获得[5]。骨髓是第一个被发现的MSC来源，但骨髓采集所带来的人体损伤及感染风险不可忽视，而骨髓来源MSC的增殖和分化潜力会随着供体年龄增大而有所减弱[13-14]。在抽脂或其他手术过程中获得的脂肪组织也可作为MSC的来源，但分离过程需使用动物来源的蛋白酶（如猪源胰酶）对组织进行消化，带来猪源病毒等污染风险，而不使用蛋白酶的机械分离法往往效率较低[15]。除骨髓及脂肪等成体组织外，脐带、脐血、胎盘等新生组织也可作为MSC的来源[5]。使用新生组织的一大优点是避免了入侵性提取，且新生组织来源MSC具有更高的增殖及分化潜力[5]。脐带MSC在分泌神经保护因子如神经营养因子-3（neurotrophin-3，NT-3）、中期因子（MDK）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等[16]、血管生长因子如C-X-C基序趋化因子-5（CXCL5）[16]、抗炎因子如血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）等[17]的分泌能力也强于其他来源的MSC，在体外试验中也展现出更强的神经保护和血管生长促进能力[16]，更适合用于治疗中枢神经系统疾病。不同来源MSC对比如表2所示。

表2 不同间充质干细胞来源比较Table 2 Comparison of different sources of MSCs

3 间充质干细胞治疗中枢神经系统疾病

中枢神经系统疾病对患者的身体功能和生活质量带来严重影响，但此类疾病种类繁多且成因各异，且碍于中枢神经系统的自我修复能力较弱，长久以来缺乏有效治疗手段。

3.1 间充质干细胞给药途径

为确保治疗的有效性，必须通过有效的给药途径使MSC到达患处。较常见的MSC给药方法包括血管给药和颅内给药两大类。血管给药可再分为静脉给药和动脉给药，2种给药方法均不侵入中枢神经系统[22]，而静脉给药是现时较多临床试验所选用的给药途径[23]。另一方面，通过静脉进入体内的MSC会稀释到各个器官，在减少实际到达患处的细胞同时，细胞也会在肺部停留较长时间[24]。虽未有不良反应报告，但仍可能对整体疗效有影响[25]。相比之下，颈动脉注射作为一种较新的方法，大大降低了细胞停留于肺部或稀释至其他器官的可能性。研究也证实颈动脉注射可有效到达大脑，是一种可行的给药途径[26]。颅内给药通过立体定位手术将MSC直接注射于患处，对比血管给药入侵性较高，精准注射使MSC可直接到达受损部位，在减少细胞稀释浪费的同时，也可使治疗更快起效[27]。但颅内给药可能会造成组织损伤，使用时应详细评估风险[28]。除上述方法外，鼻腔给药法作为一种较新的途径，在避免传统颅内给药造成脑组织损伤的同时[29]，也可避免静脉给药的细胞稀释及肺部停留问题，可在安全性及给药效率之间达至一定平衡[30]，但研究相对较少，仍需积累更多经验来证实其整体安全性和有效性。各种MSC给药途径的对比，见表3。

表3 间充质干细胞给药途径对比Table 3 Comparison of different routes of administration for MSCs

3.2 间充质干细胞治疗脑卒中和创伤性脑损伤

脑卒中是人类主要致死疾病之一，且目前脑卒中的首次发病率及相关死亡率均呈上升趋势[31]。在中国脑卒中的情况尤为严重，已成为首位致死原因[32]，2013年完成的较大规模普查发现，脑卒中的普及性和病发率分别为1 115/100 000和247/100 000，较1985年的研究结果呈明显上升趋势[33]，更在全球范围内居首位，成为社会医疗的一大负担[32]。超过80%的脑卒中为缺血性[34]，但作为主要治疗手段的溶栓药物，其治疗窗口仅为脑卒中后的3~5 h[35]，不但降低了患者及时得到治疗的机会，也无法治疗长期脑卒中患者。

缺血造成神经细胞缺乏氧气以及养分（如葡萄糖）供应，进而导致组织坏死并引发炎症，而血脑屏障的损坏令外周血内的免疫细胞大量涌入中枢神经系统使炎症恶化，带来进一步损伤[36]。MSC移植在动物模型研究中疗效显著，在组织层面，MSC促进了卒中后神经元的存活与再生，增加了卒中区域的神经轴突密度，可引起轴突周边髓鞘的再生[37]。这些组织结构上的修复，强化了连接各个脑区的神经网络，最终带来功能上的恢复[37]。MSC促进神经修复的详细机制仍需进一步研究，但MSC分化成神经细胞，对受损凋亡细胞进行直接替代的可能性较低[38]，其治疗效果更可能是由于生长因子分泌等辅助功能。MSC除分泌可促进组织再生的生长因子如血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、成纤维细胞生长因子（ fibroblast growth factor，FGF）、EGF[39]以外，也分泌神经生长因子如脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、NT-3、胶质细胞源性神经生长因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）[40-41]，这些因子在促进神经细胞生存、神经轴突再生的同时，更促进大脑内源性神经干细胞分化为新生神经元，对受损神经元进行替代，修复神经网络并带来功能恢复[42]。MSC分泌的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[39]、Ang-1[17]等因子，可激活内皮细胞，促进卒中区域血管的修复与生长，增强血液供应，改善新陈代谢以辅助修复[39]。除直接分泌因子外，MSC更会激活大脑内源性神经生长因子如BDNF、GDNF的分泌，进一步促进修复[43-44]。MSC同时具有减少神经细胞凋亡和减轻炎症的功效，其机制包括降低细胞凋亡信号蛋白Caspase-3的活性[45]、降低凋亡因子Bcl-2关联X蛋白（Bax）与Bcl-2的比值[46]，降低卒中区域致炎因子白细胞介素（interleukin，IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达水平，防止神经细胞凋亡[47]。研究显示，MSC分泌的IL-10可有效减轻炎症[48]，而MSC更可以抑制CD8阳性致炎T细胞的活动，同时增强抗炎T调节细胞（T-regulatory cell，T-Reg）的活性，从而减轻炎症，防止损伤的恶化[49]。MSC治疗脑卒中的效果及相关机制见表4。

TBI的致死/致残风险较高，根据Dewan等[50]在2019年的统计数据，全球每年约有超过6 000万人因各种原因遭受TBI，且发生概率持续上升。在中国，每年新增TBI个案约为300万~ 400万[51]，且致死/致残率也呈上升趋势，重度TBI患者的死亡率和致残率更分别达到30%和100%[51]。TBI主要由交通意外、高处坠落、人为袭击等外来物理冲击造成，而物理冲击带来的直接神经损伤视为一次损伤（primary damage）[52]。一次损伤后，神经组织因缺氧及炎症[53]、血脑屏障损坏等因素进一步受损[54]，视为二次损伤（secondary damage）[55]。MSC的治疗效果主要体现在减轻二次损伤，并进一步促进神经组织的修复[56]。

神经炎症以及小胶质细胞（microglia，MG）被激活为M1致炎形态（M1-MG）是TBI的典型表征[57]。M1-MG的激活是对一次损伤的应激反应，在清除受损组织残骸中起重要作用[58]。但临床数据显示，M1-MG的激活和致炎效应可长达数年[59]，这种过度M1-MG激活可造成慢性神经炎症，带来长期组织损伤并且阻碍修复[60]。例如，M1-MG分泌致炎因子如IL-1、IL-6等，以及其他具有神经毒性的物质如活性氧（ROS），从而对神经细胞造成损伤[61]，而M1-MG的致炎因子更会令周边神经细胞释放过量神经传导物质谷氨酸，造成神经毒性[62]。MSC的移植不但提升了损伤区域抗炎因子（如IL-10）的浓度，更将MG激活为抗炎并支持组织修复的M2形态（M2-MG）[63]。M2-MG分泌促进神经修复的因子，包括BDNF[64]、类胰岛素生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）[65]、PDGF[65]等，对组织修复起积极作用。在不进行任何治疗的情况下，受损脑区的M2-MG数量极少而且会在短时间内消失[66]，但M1-MG的激活却会维持数月甚至数年之久[59,67]，说明了通过MSC移植或其他疗法减轻神经炎症的必要性。MSC对炎症的调控还包括对巨噬细胞[68]、B细胞[69]以及自然杀伤细胞（NK）的调控[70]。

在组织再生层面，MSC对TBI的治疗效果与其对脑卒中的治疗效果类似（见表4），包括增加神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、BDNF、NT-3等神经再生因子的分泌[71]；降低细胞凋亡信号蛋白Caspase-3的活性以减少神经细胞凋亡[71]；激活内源性神经干细胞的增殖与分化，对损失的细胞进行替代[72]，修复血脑屏障以减少致炎细胞对中枢神经的入侵[73]等。MSC治疗除了在动物模型中展现了疗效[74]，更在临床试验中改善了TBI患者的运动能力、触觉灵敏度和身体平衡能力[75]。

表 4 间充质干细胞治疗缺血性脑卒中以及创伤性脑损伤汇总Table 4 MSC-based treatments for ischemic stroke and traumatic brain injury

3.3 间充质干细胞治疗脑白质疾病

脑白质主要由髓鞘构成，而中枢神经系统的髓鞘则完全由少突胶质细胞（oligodendrocyte，OL）和少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor，OP）生成。随着中枢神经系统发育，OP首先自神经干细胞分化而来，增殖并迁移分布于整个中枢神经系统。OP在与神经轴突接触后进一步分化成熟为OL，产生髓鞘包裹轴突[76]。髓鞘为轴突提供能量与包括BDNF在内的神经生长因子，以及结构上的支撑和保护，对神经轴突的健康、神经信号的传递以及神经元自身的生存起关键作用[77]。由髓鞘损伤或发育不良导致的WMD，可对神经系统造成极大的伤害。婴幼儿一旦罹患WMD，其神经系统发育将受到严重影响；另一方面，成年人也会受多发性硬化（multiple sclerosis，MS）影响，以下将集中讨论对神经系统伤害最为严重的婴幼儿WMD。

婴幼儿WMD成因较多，包括早产[78]、产时缺氧[79]以及先天性脑白质营养不良（leukodystrophy）[80]。一旦受到WMD影响，患儿的运动能力和思维能力将受到严重影响，而这种功能缺损往往影响终生[78,80]。胎儿的髓鞘发育一般从怀孕32周开始并一直持续至分娩后[81]，而早产为怀孕第37周前分娩，部分极度早产儿更在28周或以前分娩[82]。早产的时间段，

正是胎儿髓鞘发育的重要时刻，此时中枢神经系统的OP数量处于高峰，而OP对外来的刺激如缺氧和炎症极为敏感[83-84]。早产儿的呼吸系统[85]和心血管系统[86]均未发育完整，造成了较大的脑部缺氧风险。OP对缺氧抵抗力较弱[83]，而缺氧引起的氧化自由基水平上升也会对OP带来较大损害[87]。与脑卒中类似，早产引起的中枢神经系统缺氧将导致炎症，激活M1-MG并释放包括IL-1、TNF-α在内的致炎因子，造成OP凋亡，进而导致髓鞘发育不全以及脑白质缺损[88]。正因为缺氧及炎症是婴幼儿髓鞘缺损的主要成因，具有抗炎[89]和促进修复功能[90]的MSC被认为有利于治疗WMD。MSC除抗凋亡、抗炎和免疫调控功能外，更可以通过线粒体输送改善其他细胞的能量代谢以减少神经细胞凋亡[91]。除抗炎以及改善代谢外，MSC更可通过细胞外基质如黏连蛋白（laminin）的分泌加快OP往OL的成熟，促进髓鞘的生成，从而修复脑白质[92]。然而，单纯的MSC移植始终无法解决WMD造成的OP凋亡。既往文献报道，MSC难以分化为神经细胞[38]，但笔者研究发现MSC在适当的培养条件下可分化产生施万细胞（Schwann cell，SC）[11]和OP。SC虽为外周神经系统的髓鞘生成细胞，但其具有修复中枢神经髓鞘的能力[12]，而OP的移植更可以治疗中枢神经系统髓鞘缺损，令罹患先天性脑白质发育不良的动物的运动能力得到改善，寿命也明显延长。因此，可以预期MSC来源的OP在治疗其他婴幼儿WMD如小儿脑瘫（cerebral palsy，CP）也可能具有一定潜力。

3.4 间充质干细胞治疗神经系统疾病的临床研究

以MSC治疗神经系统疾病的基础研究经验已累积较多，目前临床试验正在全球范围内展开。截至2019年3月1日，检索发现已有超过50项临床试验注册信息，其中以临床Ⅰ期和Ⅱ期为主，部分试验内容见表5。

4 结语

经过大量基础研究，MSC治疗中枢神经系统疾病的潜力已得到证实，而近年来部分临床试验也在脑卒中和婴幼儿WMD的治疗上取得了积极的成果[93-94]。与此同时，基于MSC的细胞疗法和治疗用细胞产品，仍有较大的改善空间。例如，现有MSC鉴别方法明显不足以对不同来源的MSC进行表型以及功能上的区分；MSC以何种途径给药更为有效、针对不同疾病是否应采取不同的给药途径也尚无定论。MSC的来源筛选和安全性研究也在不断深入，从细胞功能角度出发，肥胖人士来源的MSC很有可能缺乏治疗功效[95]，在进行来源筛选时或应予以避免；安全角度而言，MSC是否为一种“高度免疫豁免”细胞依然存在争论[96]，反复的异体MSC回输或会在部分人群中引起免疫反应[97]。另一方面，MSC的抗炎和免疫抑制能力虽有相当的治疗潜力，但也可能会使患者的免疫系统受到过度抑制，增加感染风险[98]。最后，MSC对部分中枢神经系统疾病所带来的疗效，其机制并未得到完全阐明，需要进一步的研究。

综上所述，MSC在治疗中枢神经系统疾病中的潜力是肯定的，但在使用时必须仔细考虑患者的状况以及所使用细胞制品本身的潜在风险。MSC产品在细胞来源的筛选、细胞制剂的制备等方面仍需要建立更详细的标准。针对不同的适应证，也需要挑选最为妥当的给药途径和细胞制剂种类。在解决上述问题后，MSC有望在神经疾病治疗领域发挥其应有的优势，为患者带来希望。