表面荧光法无损检测牛肉的新鲜度

刘 欢 刘 文 杨 斯 韩东海

（中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083）

牛肉的腐败不仅会破坏感官质量，引起不良风味，甚至还会产生毒素，给人体健康造成危害，因此保证牛肉的新鲜度至关重要。常规的牛肉品质检测方法，主要包括：感官评价、微生物检测、理化检测等[1]。这些方法常具有人为主观性强，缺少量化指标，预处理操作繁琐，需要大量试剂，检测效率低，耗时长，对样品破坏性大等缺点，难以满足对牛肉新鲜度实时检测的需要。

荧光光谱法是一种灵敏度高、检测速度快的分析技术，仪器成本相对较低[2]。牛肉中含有多种可以产生荧光的物质，如色氨酸、酪氨酸、胶原质以及核黄素等[3]。Yoshimura[4]使用三维荧光光谱结合PLS 回归分析，预测牛肉表面的菌落总数。Skjervold[5]提出利用荧光成像技术区分肉中的脂肪组织、结缔组织和肌纤维组织。Kim[6]根据鸡胸肉表皮的荧光特征，鉴定鸡肉是否存在疫病危害。Egelandsdal[7]利用荧光发射光谱测定了牛背最长肌的嫩度。

表面荧光技术是采用固体样品架，使激发光源和检测器同在样品一边，互成45°，可以直接采集牛肉的光谱特征，不需要任何前处理，可以简化检测步骤，避免有机溶剂污染[8]，具有简单、快速、非破坏、取样量少、灵敏度高、费用低等优点。

本研究使用表面荧光法对牛肉的新鲜度进行无损检测，明确牛肉的荧光特性，确定牛肉中特征吸收峰的激发和发射波长，挖掘可作为牛肉新鲜度检测指标的荧光物质，并建立牛肉新鲜度的判别分析模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛肉样品（产地为日本青森县和澳大利亚），日本京都GRACE 超市；检测部位为牛肩肉。

1.2 仪器与设备

FP 8300 荧光分光光度计，JASCO日本分光株式会社；pH 计，日本SATO 佐藤；10～100 μL，100～1 000 μL 移液枪，日本NICHIRYO 立洋。

1.3 试验方法

1.3.1 肉浸出液的制备 将样品除去脂肪、结缔组织、筋腱后剪碎，称取10 g 置于烧杯中，加入预先煮沸并经冷却的蒸馏水100 mL，不时振摇，浸渍30 min 后过滤，滤液置于锥形瓶中备用。

1.3.2 样品贮藏条件 牛肉样品的贮藏温度和时间如表1所示。

1.3.3 pH 值的测量 取待测肉样5 g，绞碎，加入50 mL 蒸馏水，混匀，浸泡30 min 并不时搅拌，过滤，用pH 计测定滤液的pH 值。每次使用前先对pH 计进行校正，再测定pH 值。

表1 牛肉样品在4，15，25 ℃下的贮藏时间Table 1 Sampling points during storage monitoring for 4，15 ℃and 25 ℃

1.3.4 球蛋白沉淀试验 向试管中加入肉浸出液2 mL，加10%硫酸铜溶液5 滴，振荡后静置5 min后观察，并做空白对照。

1.3.5 数据采集 将牛肉样品放入表面荧光样品架中，再放入荧光分光光度计中扫描。设定三维荧光光谱扫描条件：激发波长Ex 的范围200～500 nm，发射波长Em 的范围210～600 nm，扫描间隔5 nm，扫描速度30 000 nm/min。同步荧光扫描激发波长设置为280～550 nm，固定波长差△λ 值为75 nm。每个样品重复测量3 次。

1.3.6 荧光图谱的校正处理 由于不同的荧光光谱仪扫描相同的样品所得到的荧光峰强度不同，即使是同一台光谱仪，在使用过程中氙灯的能量会逐渐衰减，也会对样品荧光强度的测量结果造成影响[9]。因此，在实际应用当中，应该对荧光图谱进行校正。本研究采用一种基于水的拉曼散射的荧光图谱校正方法。首先，在测量样品光谱前，先测量蒸馏水在激发波长为350 nm 处的吸收峰，然后以水的拉曼散射强度为参比，对样品的荧光强度进行标准化校正[10]。

1.3.7 数据处理及软件应用 运行SIMCA-P 11.5 中的偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）进行定性分析；利用SPSS19.0 进行聚类分析（CA）；利用Origin 8.5 作图并进行样品的平滑及求导处理。

2 结果与分析

2.1 牛肉新鲜度的化学指标分析

2.1.1 pH 值的变化分析 分别测量日本和澳大利亚牛肉在不同贮藏条件下肉浸出液的pH 值。

由图1可以看出，日本与澳大利亚牛肉样品的pH 值均随着贮藏时间的延长而不断升高，这是由于肉腐败分解时，蛋白质分解为氨和有机胺类等碱性物质，使pH 值上升[11]，因此pH 值在一定程度上可以表示肉的新鲜度。

相关研究表明，可以根据肉浸出液的pH 值对牛肉的新鲜程度大致分级：新鲜肉的pH 值为5.8～6.2，次级鲜肉的pH 值为6.3～6.7，变质肉的pH 值在6.8 以上[12]。

图1 牛肉样品肉浸出液在4，15 ℃和25 ℃贮藏下的pH 值变化Fig.1 The change of pH value during storage for 4，15 ℃and 25 ℃

2.1.2 球蛋白沉淀试验分析 肌肉中的球蛋白在碱性条件下呈可溶解状态，而酸性条件下不溶。新鲜肉呈酸性，因此肉浸出液中无球蛋白存在。而腐败肉由于大量有机碱的生成而成碱性，肉浸液溶解有球蛋白，腐败越严重，球蛋白的数量越多。可以使用CuSO4溶液作为试剂，使Cu2+与被检肉浸液中球蛋白结合形成沉淀来判断牛肉的新鲜度[12]。

如表2所示，不同贮藏时间及温度下牛肉球蛋白沉淀试验的结果差异显著。新鲜肉、次鲜肉和变质肉分别为淡蓝色溶液、完全澄清，微弱蓝色、轻度浑浊以及极度混浊、有白色沉淀。

表2 牛肉样品肉浸出液在不同贮藏条件下的球蛋白沉淀结果Table 2 Results of globulin precipitation in meat extract of beef samples under different storage conditions

2.2 牛肉新鲜度的分级

根据2.1 节中牛肉样品肉浸出液的pH 值以及球蛋白沉淀这两个指标，利用聚类分析（CA）的方法将所有牛肉样品的新鲜度分为3 个等级：新鲜肉、次鲜肉和腐败肉（图2）。

图2 牛肉样品新鲜度分级的聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram in order to categorize beef freshness by clustering analysis

由图2可知，聚类分析对牛肉的新鲜度进行准确分级，分级结果与肉浸出液的pH 值及球蛋白沉淀结果一致，此分级结果将作为接下来建立表面荧光定性模型的化学真值参照。

2.3 牛肉的表面荧光特性分析

由于脂肪组织和肌肉组织有完全不同的荧光特性，因此分别采集了瘦肉和肥肉的表面三维荧光光谱，三维荧光光谱是描述物质的荧光强度随激发波长和发射波长变化的关系谱图，通过一次三维扫描，便有可能监测体系中的全部荧光组分[13]。

由图3可知，牛肉中每个荧光峰激发波长和发射波长的位置（表3）。瘦肉组织的表面三维光谱共有两个荧光特征峰，激发和发射波长的位置在Ex/Em：230 nm/330 nm 和Ex/Em：290 nm/330 nm，这两个特征峰由色氨酸发荧光产生[14]。脂肪组织的表面三维光谱共有7 个特征峰，与瘦肉荧光光谱相同，位置在Ex/Em：230 nm/330 nm 和290 nm/330 nm 的特征峰由色氨酸发荧光产生；相关研究表明，发射波长位于400 nm 附近，激发波长介于300～350 nm 的特征吸收峰与维生素发荧光有关[15]，因此位置在Ex/Em：310 nm/390 nm 和Ex/Em：320 nm/390 nm 处的荧光峰由脂溶性维生素产生；在水中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的激发波长在340 nm 左右，发射波长在450 nm 左右[16]，在牛肉中由于各组分之间的相互作用，会影响NADH 的特征峰位置，由此可推断出位置在Ex/Em：310 nm/440 nm 和Ex/Em：320 nm/440 nm处的荧光峰由NADH 产生；Egelandsdal[17]研究指出位置在Ex/Em：350 nm/470 nm 处的荧光峰为胶原质。综上所述，牛肉的脂肪组织可以比瘦肉组织提供更全面的荧光物质信息，因此选择牛肉的脂肪组织作为研究对象，以检测牛肉的新鲜度。

图3 牛肉样品三维荧光谱图Fig.3 The 3-D fluorescence spectra of beef sample

表3 牛肉样品中荧光物质的特征峰位置Table 3 The characteristic peaks of fluorescent substances in beef

2.4 牛肉新鲜度的定性判别分析

在实际应用中，三维荧光的分析方法较为复杂，运算时间较长，而同步荧光分析法具有简化图谱，提高选择性，减少光散射干扰等特点。在同步扫描时最常用的是恒波长同步荧光法 （△λ=λem-λex=常数），混合物体系的三维荧光光谱可以从理论上预测同步扫描时的△λ 值[13]。根据牛肉三维图谱中的各荧光物质的特征峰位置可以推断出，当△λ=75 nm 时，能扫描到牛肉中3 种荧光物质的光谱信息，可以较为全面的描述牛肉的荧光特征，因此本研究选择△λ=75 nm 作为同步荧光扫描的固定波长差。

共取78 个不同新鲜度的牛肉样品（日本及澳大利亚牛肉样品各39 个），分别采集各样品固定波长差△λ 为75 nm 的表面同步荧光光谱，将所有样品的光谱按照大致3∶1 的比例，分成59 个校正集和19 个验证集。

图4为所有牛肉样品脂肪组织在固定波长差△λ 为75 nm 的同步荧光扫描结果，一共扫描到4个特征峰。其中，脂肪组织固有3 个荧光特征峰，发射波长位置分别为：302，348，391 nm，这3 个荧光峰分别由色氨酸与脂溶性维生素产生，不同新鲜度牛肉样品之间的荧光峰强度存在较大差异。

与新鲜牛肉相比，经过较高温度或较长时间贮藏的牛肉脂肪组织在发射波长为462 nm 处产生了新的特征峰。研究表明，牛肉在贮藏时发生氧化的过程中，脂肪中的丙二醛（MA）加合物与氨基化合物会发生反应，产生能发荧光的共轭席夫碱（结构为RN=CH-CH=CH-NHR），激发波长位置大约在360 nm，发射波长大约在450 nm[18]，因此这个新的荧光峰是由脂质氧化产生。综上所述，新鲜牛肉和腐败牛肉在荧光光谱上有较大差异，证明了表面荧光法检测牛肉新鲜度的可行性。

对牛肉样品的原光谱进行Savitzky-Golay 平滑（25，3）及二阶导数处理，并以所得到的二阶导数光谱的波长点为X 变量，以2.2 节中牛肉样品新鲜度的分级结果为Y 变量，进行PLS-DA 判别分析。PLS-DA 是一种有监督的模式识别方法，对量测矩阵进行正交分解的同时对响应矩阵也进行正交分解，是一种基于特征变量的回归方法[19]。

首先对59 个校正集样本建立PLS-DA 识别模型，图5显示了校正集样品的潜变量得分图，从图中可以看出该模型对牛肉的新鲜度等级做出了很好的区分，判别正确率可达96.61%。

为验证模型对未知样本的适用性，将19 个验证集样本作为未知样本与校正集样品一起建立PLS-DA 模型。由图6可以看出，新鲜肉、次鲜肉和腐败肉的判别结果基本与校正集样本模型结果一致，仅存在1 个误判，准确率为94.44%。试验结果表明，该方法具有有效鉴定牛肉新鲜度的潜力。

图4 不同贮藏条件下牛肉脂肪组织的表面同步荧光光谱图（△λ=75 nm）Fig.4 The surface synchronous fluorescence spectra of beef fat during different storage conditions（△λ=75 nm）

图5 校正集样品PLS-DA 模型的潜变量得分图Fig.5 The latent variable scores of validation samples by PLS-DA modeling

图6 校正集和验证集样品的PLS-DA 模型的潜变量得分图Fig.6 The latent variable scores of validation and calibration samples by PLS-DA modeling

3 结论

本研究采用表面荧光技术开发了一种牛肉新鲜度检测的新方法，牛肉贮藏过程中各荧光物质强度的变化，以及脂质氧化过程中产生的新的荧光物质席夫碱可以作为牛肉新鲜度的检测指标，利用表面同步荧光光谱 （固定波长差△λ 为75 nm）结合PLS-DA 法的牛肉新鲜程度定性判别模型对校正集及验证集样品的检测，均取得良好的效果，且牛肉的产地差别并不会对建模结果造成影响。该方法为现场快速检测及便携仪器的开发打下理论基础，并且在其它肉品品质检测方面也具有一定的应用前景。

致谢：感谢日本京都大学农学部生物传感实验室（近藤直教授研究室） 为本研究提供仪器支持。