不同衰老程度青菜电导率和4种主要离子溶出特性研究

王向阳 顾 双

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州310018）

蔬菜衰老劣变过程中，膜脂质过氧化程度增加，膜的完整性受到破坏，表现出膜的透性增大，离子渗漏[1]。目前通常采用测定电导率来表示离子渗漏和膜透性情况[2-4]。仪器价格便宜，操作方法简单，依据是离子从细胞内渗漏的原理。然而，植物中的一些离子存在于细胞间隙，细胞外浓度可能显著高于细胞内浓度，测定电导率无法辨别是离子渗出，膜内渗出，还是细胞壁离子扩散所致，其渗透和扩散比例不清楚，无法确定是否会影响所测定的相对电导率的准确性。果蔬在水中浸泡多长时间后测定电导率，各种文献报道差异很大，常见的有浸泡0.5 h 或1 h 后测定，也有浸泡更长或更短时间[5-8]。蔬菜作为人们生活中的主要副食，是矿物质营养元素的重要来源之一[9]，而矿物质是电导的主要成分，钾、氯、钠、钙等是蔬菜的主要离子，目前学者主要利用离子选择电极测定果蔬的一些离子含量。Harker 等[10]采用钙离子选择电极测定苹果细胞内和细胞外的钙离子含量；David等[11]利用钙离子选择电极测定苹果果实中的钙含量，发现此方法可用来检测果实中低钙的临界水平。戴自飲等[12]用氯离子选择性电极测量生菜、菠菜等27 种果蔬中的氯离子含量，与化学测量氯离子含量方法相比较，结果基本一致，避免了化学测定氯离子使用汞试剂，可以使实验人员更加安全，并减少环境污染，然而使用离子选择电极法测定蔬菜中的离子溶出浓度并不多见。本试验以青菜为代表，使用这些离子检测电极探究青菜衰老过程中主要离子的渗透和扩散过程，有助于了解和完善电导率测定方法，以期获得比电导率更精确的方法，用于衰老和逆境等的研究。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

青菜：品种为“上海青”，当地清晨采收，及时运回实验室。青菜从外向内数第1，2 片叶子为外叶，试验采用外叶。

离子强度调节剂：K+、Ca2+、Na+、Cl-强度调节剂分 别 为1 mol/L MgAc2，0.1 mol/L KCl，0.2 mol/L二异丙胺和0.1 mol/L KNO3，试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

电子天平（AY－120），日本Shimadzu 公司；自动滴定仪（ZDJ-5 型）、钾离子电极（PK-1-01 型）、钙离子电极（PCa-1-01 型）、钠离子电极（6801-01型）、氯离子电极（PCl-1-01 型）、甘汞双盐桥参比电极（217 型）、甘汞参比电极（232-01 型）、甘汞参比电极（6802-01 型）、硫酸亚汞参比电极[C（K2SO4）-1 型]，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

将青菜叶片去梗剪成细长条状，称取1.0 g，放在玻璃培养皿中视为1 份样品，按同样方法准备45 份样品分装于聚乙烯薄膜袋中贮藏，袋上扎有均匀小孔，编号后常温（25±2）℃贮藏。贮藏0，3，7 d 取样，分别测定1 h 内电导率，K+、Ca2+、Na+和Cl-的变化曲线。测定K+、Ca2+、Cl-前，均加入0.05 mL的离子调节剂。测定Na+前，将溶液pH 值用0.2 mol/L 二异丙胺调至10，以消除H+对电极的干扰。每种指标测定3 次重复，取平均值。

1.4 测定方法

1.4.1 标准曲线的绘制 分别用 KCl、CaCl2、NaCl 标准溶液配成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5mol/L浓度梯度，由稀到浓分别测试离子电极电位，根据电位值（mV）和离子浓度的负对数值（pX）绘制电极“mV-pX”标准曲线，结果如图1。

图1 K+、Ca2+、Na+、Cl-标准曲线Fig.1 Standard curves of K+，Ca2+，Na+ and Cl-

1.4.2 电导率测定 在测量杯中放入50 mL 去离子水，将1.0 g 样品放入杯中测定1 h 内电导率，每隔20 s 读数1 次。

1.4.3 钾、钙、钠、氯离子浓度测定 在测量杯中放入50 mL 去离子水，取0，3，7 d 各1.0 g 样品放入杯中，转子速度为60 r/min，测定样品1 h 内K+、Ca2+、Na+、Cl-溶出电位，每隔20 s 读数记录，通过标准曲线换算得到离子溶出量，计算公式如下：

离子溶出量（mg/g FW）=（10-X×M×V）/m

式中，X——电位对应标准曲线上的摩尔浓度负对数值；M——摩尔质量，g/mol；V——溶液体积，mL；m——样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 青菜外叶在水中电导率变化

贮藏0 d 的青菜在流动水中1 min 的电导率很低，而贮藏3 d 的青菜电导率显著高于0 d，贮藏7 d 的青菜电导率显著高于3 d。然而2 min 后，贮藏3 d 的青菜电导率快速上升，高于贮藏7 d 和0 d 的青菜（图2a）。电导率与青菜衰老程度不相符，这情况一致持续到1 160 s。此后，贮藏7 d 的青菜电导率大于3 d，贮藏3 d 的青菜电导率大于0 d，符合衰老越严重，细胞膜渗透越大的特性。不同衰老青菜在流动水中30～60 min 的电导率基本平行上升，电导率与衰老之间显示了较好的相关性，这区段可以用于测定青菜的相对电导率（图2b）。李冲伟等[13]报道乙醇引起电导率下降，阳离子和质子上升引起电导率上升，而本研究几乎没有乙醇产生，预试验发现不同衰老程度青菜溶出pH 值之间没有显著变化。陈年等[14]报道果汁中固形物含量、温度对电导率有影响，如果添加少量氯化钠，后者引起电导率上升远远大于前者。因此针对电导率的异常，应该主要测定青菜离子溶出情况。

图2 不同衰老阶段青菜电导率的变化Fig.2 Variation of conductivity of pak choys at different stages of senescence

2.2 青菜在水中钾、钙、钠、氯离子溶出量的变化

在浸泡1 h 时，衰老青菜的Cl-和K+溶出量显著多于Na+、Ca2+溶出量，前两者对衰老青菜电导率变化贡献较大。对于新鲜青菜，K+的溶出量对电导率所做贡献最大，而对于新鲜青菜初始5 min 电导率是Na+溶出贡献最大。见图3、图4。

贮藏0 d 青菜K+在开始20 s 没有快速溶出，说明细胞外叶K+含量少，其溶出主要与膜渗透有关。放置0，3，7 d 青菜在前20 s 的K+溶出量几乎一样，说明青菜衰老过程，K+基本没有渗漏到细胞外。然而，20 s 至440 s 时，贮藏3 d 青菜的K+溶出量显著高于7 d，K+溶出和青菜衰老程度不相符，而与同期电导率反常一致，是电导率反常的一个内在原因。此后，贮藏7 d 青菜的K+溶出量持续高于3 d。贮藏7 d 和3 d 青菜K+溶出量在30 min 左右达到高点，而0 d 青菜的K+在50 min 左右才达到高点，说明衰老青菜K+细胞膜渗出加快，总渗出量也增加。见图3a、图4a。

贮藏0 d 青菜Ca2+在开始20 s 快速溶出达到0.041 mg/g，贮藏3 d 青菜Ca2+溶出量低于0 d，而贮藏7 d 青菜Ca2+溶出量远远高于0 d，且贮藏7 d 青菜钙离子在20～40 s 还持续快速溶出，随后不同衰老青菜都呈缓慢线性上升或平移。贮藏7 d青菜Ca2+溶出量远高于对照，对照也远高于3 d 青菜溶出量。Ca2+主要存在于细胞外，一般认为比细胞内胞质中钙离子浓度高1 000 倍[15-16]。钙与细胞壁中胶层的果胶质结合形成果胶钙[17]，果胶钙通过粘结植物细胞壁物质影响细胞壁的刚性，细胞壁结构和组分的变化是造成果实软化的重要因素[18]。3 d Ca2+初期溶出慢，低于7 d 和0 d 青菜溶出量，可能与细胞壁中原果胶转化为果胶酸有关，果胶酸比原果胶具有更强的结合钙离子能力。在果蔬衰老过程中细胞壁的原果胶会转化为果胶酸，进一步降解成半乳糖。贮藏7 d 青菜Ca2+在初期快速溶出，其值远高于0 d，可能与此时果胶酸降解有关，大分子降解会导致细胞壁结合态的Ca2+在初期容易扩散出来。不同衰老程度青菜Ca2+的溶出量下降和上升特别显著，有望作为细胞壁变化的一个快速检测指标。见图3b、图4b。

图3 添加不同衰老阶段青菜的去离子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-变化（5 min）Fig.3 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 5 min

贮藏0 d 青菜Na+在开始20 s 溶出量达到0.125 mg/g，随后基本没有上升，说明开始20 s 内快速溶出的Na+存在于细胞外，其本质是细胞外扩散。而此后青菜细胞内的Na+溶出速度较慢，其本质是通过膜渗透。贮藏7 d 青菜Na+在开始20 s 内溶出量高于3 d，而3 d 青菜Na+在开始20 s 内溶出量高于0 d，20～40 s 是转换期，此后溶出速度变慢，说明青菜衰老过程细胞可能渗漏少量Na+，并积累在细胞间。从1 h 图来看，贮藏7 d 青菜Na+溶出量在初期和后期都高于3 d 溶出量，而在240～1 520 s 时，贮藏3 d 青菜Na+溶出速度反而高于7 d 青菜，这可能也是造成贮藏3 d 青菜的电导率在前20 min 反常的原因。贮藏3 d 青菜Na+溶出速度始终远远高于0 d（1 h）。见图3c、图4c。

贮藏0 d 青菜Cl-在开始20 s 并没有快速溶出，只比随后溶出稍快一点。贮藏0，3，7 d 青菜Cl-在开始20 s 时溶出量基本一样（图3d）。根据图3d的溶出试验，认为青菜中Cl-主要存在于细胞内，主要依靠渗透溶出。贮藏7 d 青菜Cl-溶出量高于3 d，且高于0 d。Cl-溶出量与衰老相符性好，Cl-溶出曲线呈3 条线性射线，新鲜青菜和中等衰老青菜的Cl-区分度高，而中等衰老和严重衰老青菜之间Cl-溶出区分度较差。见图3d、图4d。

3 结论

测定青菜电导率能较好反映其与衰老的相关性，然而浸泡前期电导率与衰老相符性差，测定青菜相对电导率需要流动水浸泡30～60 min。Cl-和K+是4 种离子中溶出量较多的离子，Na+、Ca2+溶出量相对较少。Na+和K+前期溶出与衰老相符性较差，可能是造成电导率前期与衰老相符性较差的原因。

图4 添加不同衰老阶段青菜的去离子水中K+、Ca2+、Na+和Cl-变化（1 h）Fig.4 Variation of K+，Ca2+，Na+，Cl- in deionized water added by different senescence stages pak choys for 1 h

青菜细胞外Na+和Ca2+浓度显著高于细胞内，初期溶出以扩散为主，此后两种离子溶出速度较慢，该溶出是以渗透为主，青菜衰老过程细胞可能渗漏了少量Na+，并积累在细胞间。青菜Ca2+溶出的反常现象与细胞壁中果胶物质转化和降解有关，未来可以通过建立两者相关性，测定Ca2+溶出变化来快速了解衰老和逆境下细胞壁完好性，特别是其主要成分果胶的变化。绝大多数Cl-和K+主要存在于细胞内，细胞外含量很少，其主要依靠渗透溶出，衰老过程青菜基本没有向细胞外渗漏并积累Cl-和K+。该两种离子主要从细胞内溶出，测定Cl-和K+浓度能判断衰老和逆境下细胞膜完好程度。