芸豆蛋白与糖基化芸豆蛋白结构与功能特性研究

冯玉超 王长远，2* 李玉琼 全 越 张东杰，2

（1 黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江大庆163319 2 国家杂粮工程技术研究中心 黑龙江大庆163319）

芸豆（Phaseolus vulgaris），其生物学名叫菜豆，是可食用的小宗杂粮作物，在中国具有悠久的食用历史。芸豆营养丰富，其籽粒蛋白质含量为20%～30%，脂肪为1.5%～2.03%，碳水化合物为63%左右。我国芸豆产量居世界第3，年产量约80万t，占杂豆出口总量的71.4%[1]。芸豆中蛋白含量与大豆粕、玉米胚芽粕等传统植物中蛋白含量相比略低，而芸豆蛋白是一种全价蛋白，不仅含有8种人体必需氨基酸，还含有丰富的铁、钙、碳水化合物及多种微量元素等营养物质，且具有很高的药用价值。然而，由于中国的饮食特点，芸豆主要是作为豆包的豆馅、豆沙等食用，其次是煮制熬粥等，食用量较小，精深加工程度低，而国内外对芸豆的研究及加工利用也主要集中在淀粉、膳食纤维等方面。基于芸豆蛋白的高营养与高药用价值，对芸豆蛋白的开发和利用具有重要意义。因独特的结构，具有低溶解性，低消化率等特点，且易受pH 值和温度的影响而使蛋白质变性，使其在食品工业中的应用受到一定限制。

蛋白质的糖基化改性[2]是改善蛋白分子结构的新型手段，即蛋白质-糖接枝反应时蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基和糖分子还原末端的羰基之间的羰氨反应[3]，以共价键连接的方式将糖类物质与蛋白质分子链接，使改性后所得糖蛋白具有蛋白质大分子特性和糖类物质的亲水性。目前，有报道利用转谷氨酰胺酶与氨基葡萄糖实现酪蛋白和大豆蛋白糖基化交联，并改善了蛋白质的部分功能特性[4-8]。探讨芸豆蛋白以及糖基化改性芸豆蛋白的功能特性与结构之间的构效关系，可为开发稳定的芸豆蛋白食品提供理论基础，为今后开发芸豆蛋白特定产品与分子设计及重组提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红白花芸豆，黑龙江省林甸县。

氯化钠、硫酸铜、硫酸钾、酒石酸钾钠、无水碳酸钠、福林酚乙试剂、甲醇、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼砂、β-巯基乙醇、邻苯二甲醛、考马斯亮蓝R250、浓硫酸均为分析纯级，天津市博迪化工有限公司；十二烷基硫酸钠，美国Sigma 试剂公司；氨基葡萄糖盐酸盐，中国医药上海化学试剂公司；大豆油，吉林金香源粮油有限公司。

1.2 仪器与设备

WS 多管架离心机，湘仪离心机仪器有限公司；PHK-615 精密酸度计，深圳欧克仪表科技有限公司；TU-8 紫外可见分光光度计，上海普析仪器设备有限公司；RSJ200-4 电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；FS-450N 超声波处理器，邯郸海拓机械科技有限公司；FD5-3 型冷冻干燥机，美国SIM 公司；AKTA-蛋白质纯化仪，美国GE 公司；MAGNA-IR560 傅立叶变换红外光谱系统，美国尼高力公司；PurelabUltra 超纯水制备系统，美国Millipore 公司；万用炉，上海铂勒机电设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芸豆蛋白的制备 芸豆蛋白的制备按照马文鹏等[9]的提取方法，略作改进。芸豆去皮粉碎过筛，正己烷脱脂，芸豆粉与蒸馏水按1∶15 的固液比混合，调pH 9.0，50 ℃搅拌提取50 min 后，4 000 r/min 离心20 min，将上清液至于烧杯，沉淀按固液比1∶15 混合，提取50 min 后离心，将2 次上清液混合。上清液用1 mol/L HCl 调至pH 4.6，沉淀1 h，4 000 r/min 离心20 min，去上清液，沉淀冷冻干燥后于-20 ℃贮存备用。用凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）检测蛋白质纯度。

1.3.2 超声辅助芸豆蛋白糖基化的制备 称取适量芸豆蛋白（精确到0.001 g），用0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.5），配制成质量浓度为9 mg/mL 蛋白溶液，用0.1 mol/L 的NaOH 和0.1 mol/L 的HCl 调pH 值至9.75，在室温下磁力搅拌30 min 后，按蛋白∶糖（质量比）为1∶2 加入氨基葡萄糖，磁力搅拌20 min 后调pH 值至9.75，再磁力搅拌10 min。取适量的混合溶液于小烧杯中，预热到70 ℃，置于超声波处理器处理40 min，反应结束后迅速冷却至室温，4 000 r/min 离心15 min 除去不溶物，所得上清液装入透析袋，4 ℃条件下透析48 h，冷冻干燥后备用。以芸豆蛋白和未超声辅助糖基化芸豆蛋白的氨基葡萄糖的接枝度作为对照[10-12]。

1.3.3 未超声辅助糖基化芸豆蛋白的制备 方法同1.3.2 节，将超声波处理器处理40 min 换成同等时间的70 ℃水浴处理。

1.3.4 溶解性的测定 参考氮溶解指数（NSI）法[13]，加以改进。取样品0.5 g 溶于20 mL 样品缓冲液中，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH 溶液分别调pH 值至2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，10.0，磁力搅拌45 min 后，3 000 r/min 离心30 min，用福林酚法测上清液中的蛋白质含量，并绘制曲线，以牛血清白蛋白为标准物绘制标准曲线，如式（1）所示。

1.3.5 起泡性及起泡稳定性的测定 分别称取蛋白样品0.4 g 溶于20 mL 蒸馏水，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 溶液分别调pH 值至2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，10.0，磁力搅拌1 h 后，4 000 r/min 离心20 min，然后以9 500 r/min 高速搅打2 min，测量搅打停止时的泡沫总体积V0，静置30 min 后再次测量泡沫体积V1[14]，按式（2）、（3）计算起泡性和起泡稳定性。

式中，V0——初始起泡总体积，mL；V1——30 min 后起泡总体积，mL。

1.3.6 乳化性及乳化稳定性的测定 称取样品0.4 g 溶于20 mL 蒸馏水中，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH 溶液分别调pH 值至2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，10.0，磁力搅拌1 h 后4 000 r/min 离心20 min，加入5 mL 大豆色拉油（液油比为4∶1），然后以9 500 r/min 高速搅打2 min，立刻在底部取50 μL 样品，用0.1%SDS 稀释至适当倍数，混匀后立即在500 nm 波长下测吸光值A0，以SDS 溶液作空白。室温放置30 min 后再次取样测定A1。按下式计算乳化活性（EAI）及乳化稳定性（ESI）。

式中，C——样品质量浓度，g/mL；φ——乳化液中油相的比例，0.25；L——比色杯光镜，1 cm；N——稀释倍数；A0——初始乳化液的吸光值；A1——30 min 后的吸光值。

1.3.7 疏水性测定 采用ANS 荧光探针法测定样品的表面疏水性。分别将样品用0.01 mol/L pH 7.5 的磷酸盐缓冲液配成质量分数为0.2%的溶液，取4.0 mL 试液加入20 μL 8.0 mmol/L ANS的磷酸盐缓冲液，25 ℃下保温1 h。设置激发波长390 nm，发射波长470 nm，狭缝宽度5 nm。以磷酸盐缓冲液为空白，以荧光强度对样品浓度作曲线，直线斜率即为样品的表面疏水性（H0）[15-16]。每组试验重复3 次，数据报告表示方式为平均值±标准偏差。

1.3.8 差示热量DSC 采用差示扫描量热仪测定[17]。称取冷冻干燥后样品2～3 mg，置于铝盒中。以空铝盒为对照，升温范围30～150 ℃，以升温速度10 ℃/min，降温速度：30 ℃/min。根据得出的DSC 曲线，算出蛋白变性温度（T），焓变（△H）。

1.3.9 SDS-PAGE 凝胶电泳的测定 参照王延青[18]的方法略加改动，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 方法测定分子质量。使用夹心式垂直板状电泳槽，5%浓缩胶、12%分离胶，用考马斯亮蓝R250 染色，脱色液进行脱色（甲醇∶冰乙酸∶水=2∶2∶9，体积比）。

图1 牛血清白蛋白标准曲线Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

1.3.10 红外光谱的测定 将冷冻干燥好的干样品，称取2 mg，与200 mg 溴化钾混合后研磨均匀，压片测定FTIR。数据采集期间，持续用干燥N2淋洗测量室，以减少水蒸汽IR 吸收的干扰。测定在波数范围4 000～400 cm-1的吸收光谱，分辨率4 cm-1，波数精度0.01 cm-1，扫描次数64 次，环境温度25 ℃[19]。

2 结果与分析

2.1 溶解性分析

以牛血清白蛋白绘制标准曲线，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，于540 nm 处比色测定，制作标准曲线，如图1所示。

由图2可知，芸豆蛋白和糖基化芸豆蛋白的溶解性均呈先下降后上升的趋势，溶解性的最低点是芸豆蛋白的等电点（pH=4）。3 个处理间存在显著差异（P＜0.05），超声辅助糖基化蛋白的溶解性更优于未超声辅助糖基化蛋白。这与程熙茜[20]研究的大豆蛋白糖接枝物的溶解性在等电点附近比大豆蛋白溶解性高出近一倍的结果相似。一方面，这是由于芸豆蛋白与氨基葡萄糖接枝后，蛋白质分子引入了亲水性氨基，易在分子表面形成水化层，从而使蛋白质溶解度受酸碱等外界条件的影响变小[21]，从而增大其溶解性。另一方面，引入氨基的同时，也引入了分子空间大、结构稳定的糖分子，使蛋白质分子间因糖分子的阻碍而无法聚集形成沉淀，故其溶解性增大。超声辅助糖基化芸豆蛋白和未超声辅助糖基化芸豆蛋白的接枝度分别为39.63%，26.32%，这是由于波通过机械震动，破坏了蛋白质分子的结构，使其释放更多的有效成分[22]，使得前者引入更多亲水氨基和糖分子，因此溶解性大于后者，二者最大溶解度分别为93.21%，86.01%。

图2 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的溶解性Fig.2 Solubility of kidney bean protein and modified kidney bean protein

2.2 乳化性和乳化稳定性分析

由图3和图4可以看出，超声辅助糖基化芸豆蛋白的乳化性和乳化稳定性与芸豆蛋白相比大幅提高，整体趋势均为先下降后上升的趋势，三者乳化性差异显著（P<0.05），而改性蛋白间的差异不显著（P>0.05），仍可看出超声辅助糖基化蛋白的乳化性要好于未糖基化的蛋白，这与刘燕等[23]所得的经过糖基化改性的大豆蛋白的乳化性有较大提高，与乳化稳定性有不同程度改善的结论相似。在等电点（pH 值为4）附近，蛋白质的溶解性最低，使得亲水亲油基团作用减弱，其乳化性随之降低。随着碱性增强，蛋白质对分散粒子的吸附性增强，亲水基团与水紧密接触，使得蛋白质的表面张力降低[24]。芸豆蛋白与糖分子结合后，亲水性增强，大分子糖链的空间位阻效应，可以有效阻止油相的聚集，从而使蛋白的乳化性和乳化稳定性提高[20]。因超声辅助糖基化芸豆蛋白的亲水性基团多于未超声辅助糖基化芸豆蛋白，增加了位阻效应，故乳化性和乳化稳定性更好。

图3 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的乳化性Fig.3 Emulsion of kidney bean protein and modified kidney bean protein

图4 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的乳化稳定性Fig.4 Emulsion stability of kidney bean protein and modified kidney bean protein

2.3 起泡性和起泡稳定性分析

由图5可以看出，芸豆蛋白和两种糖基化芸豆蛋白的起泡性受pH 的影响较大。起泡性整体呈先下降后上升的趋势。随着pH 值的增大，芸豆蛋白的亲水性随表面负电荷增多而增强，同时，蛋白质分子间的排斥力增强，使得分子内部疏水基团暴露出来，蛋白分子表面疏水性增强，从而提高了起泡性[25]。两种糖基化蛋白间起泡性差异不显著（P>0.05），芸豆蛋白和两种糖基化蛋白间起泡性差异显著（P<0.05）。

由图6可以看出，3 组处理间起泡稳定性差异显著（P<0.05），在等电点（pH=4）处起泡稳定性最佳，这是因为在等电点附近，未溶解的蛋白通过吸附增加了蛋白质的粘合力，从而使泡沫更稳定。芸豆蛋白、辅助糖基化改性芸豆蛋白、糖基化改性芸豆蛋白的起泡稳定性分别为89.33%，75.25%，80.20%。

图5 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的起泡性Fig.5 Whipability of kidney bean protein and modified kidney bean protein

图6 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的起泡性稳定性Fig.6 Foaming stability of kidney bean protein and modified kidney bean protein

2.4 疏水性分析

如表1可知，疏水性为：芸豆蛋白＞未超声辅助糖基化的芸豆蛋白＞超声辅助糖基化芸豆蛋白，3 个处理间差异显著（P＜0.05）。结果与KATO[26]对卵蛋白的二级结构的研究分析所得出的结论相符。这是因为蛋白质分子糖基化处理后，引入亲水分子，使蛋白分子空间结构发生变化，α-螺旋结构上升，疏水性结合位点暴露程度减小，从而导致蛋白质分子表面的疏水性减小。因超声辅助的原因，使得引入的糖分子更多，结构发生更大变化，所以亲水基团相对较多，使得改性蛋白中超声辅助糖基化蛋白表面疏水性明显降低。

表1 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的表面疏水性Table 1 The surface hydrophobicity of kidney bean protein and modified kidney bean protein

2.5 差示热量DSC 分析

根据差示热量图谱得表2，可以看出与芸豆蛋白相比较，超声辅助糖基化芸豆蛋白、未超声辅助糖基化芸豆蛋白的热变性温度分别下降了6.1，4.95 ℃，焓变分别下降了3.25，1.96 J/g。糖基化蛋白与芸豆蛋白之间差异显著（P＜0.05），两种糖基化芸豆蛋白间差异不显著（P＞0.05）。其原因可能在于糖基化改性过程中，热处理破坏了如氢键、疏水作用、静电作用和二硫键等[27]，使蛋白结构稳定存在的力，使蛋白质部分结构发生折叠，分子内部作用力降低。由于变性温度反映蛋白质的热稳定性，而变性焓则反映蛋白质分子的疏水性和/或亲水性[28]，所以在反应过程中，蛋白质结构受到了影响，内部的疏水基团发生包埋，引入了糖基的亲水基团，导致变性温度降低，这一结论也在对芸豆蛋白及改性芸豆蛋白的红外光谱分析中得到证实。由于接枝反应属于一级放热反应，故也加大了蛋白对热处理的敏感性。

表2 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白DSC 分析结果Table 2 DSC characteristics result of kidney bean protein and modified kidney bean protein

2.6 SDS-PAGE 电泳图谱分析

由图7可以看出，泳道2、泳道3 的亚基谱带颜色比泳道4 的浅。当芸豆蛋白与氨基葡萄糖发生反应后，其活性基团减少，使得考马斯亮蓝与蛋白质分子的结合减少，从而使两种糖基化芸豆蛋白的亚基谱带颜色变浅，且3 泳道颜色浅于2 泳道。同时在浓缩胶与分离胶的接缝处及浓缩胶顶部均有新的条带产生，该共聚物由于分子质量太大难以通过浓缩胶进入分离胶，故仅积聚在浓缩胶和分离胶接缝处。结果表明，糖基化改性生成了蛋白质-糖共聚物，即糖蛋白。在14.4～20.0 ku 之间也可以看到泳道4 下面部分有清晰地条带，而2 泳道没那么明显，3 泳道几乎没有条带，这是由于小分子物质与糖分子结合，形成一些大分子物质向上聚集，4 泳道上面部分与2、3 泳道相比没有相应条带聚集，说明有糖蛋白产生。

2.7 红外光谱分析

从红外光谱图8中可以看出，蛋白质的二级结构重叠在酰胺I 带（1 600-1 700 cm-1）里，进一步证明氨基糖连接到芸豆蛋白中，采用Peakfit 软件对蛋白质酰胺I 带进行解析，对谱的酰胺I 带进行傅里叶去卷积处理[29]。分析芸豆的二级结构组成及改性芸豆蛋白的结构变化，如图9。

图7 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白电泳图谱Fig.7 Electrophoresis patterns of kidney bean protein and modified kidney bean protein

结合原始图谱和去卷积谱得到的子峰峰位，进行二级结构分析，得到以下结构的定量信息。见表3。

由表3可以看出，与芸豆蛋白相比，改性芸豆蛋白的α-螺旋结构、β-折叠结构呈上升趋势，β-转角结构、无规则卷曲呈下降趋势。处理间α-螺旋结构、β-折叠结构、无规则卷曲均差异显著（P<0.05）。蛋白质二级结构的稳定性靠氢键、疏水作用和范德华力维持，超声辅助破坏了这些为蛋白分子提供稳定性的作用力，导致蛋白质结构变化更显著。这也解释了芸豆蛋白糖基化改性降低了其表面疏水性的原因。进一步证明，糖基化改性对芸豆蛋白二级结构主链有影响，芸豆蛋白与氨基糖发生了接枝反应。

图8 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的红外光谱分析Fig.8 FT-IR spectra of kidney bean protein and modified kidney bean protein

图9 芸豆蛋白和改性芸豆蛋白的去卷积酰胺I 带二阶导数谱Fig.9 Deconvoluted amide I band second derivative spectrum of cowpea protein and modified cowpea protein

表3 利用酰胺I 带拟合芸豆蛋白和改性芸豆蛋白二级结构组成结果Table 3 Secondary structure of kidney bean protein and modified kidney bean protein fitted by amide I band

3 结论

制备的芸豆蛋白纯度为80.03%。针对芸豆蛋白以及糖基化改性的芸豆蛋白的功能性质及结构比较进行研究，得到以下结论：

糖基化改性增加了芸豆蛋白的溶解性、乳化稳定性、起泡性。与芸豆蛋白相比，超声辅助糖基化蛋白与未超声辅助糖基化蛋白的溶解性分别提高了17.30%，10.10%；乳化性分别提高了20.89%，12.59%；乳化稳定性分别提高了16.52%，10.02%；起泡性分别提高了2.5%，1.25%。糖基化改性降低了泡沫稳定性、表面疏水性、热变性温度。与芸豆蛋白相比，超声辅助糖基化蛋白与未超声辅助糖基化蛋白的起泡稳定性分别下降了14.23%，9.73%，疏水性分别下降了280Ho，110Ho，变性温度分别下降了3.1，1.95 ℃。

由聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果可以看出，改性芸豆蛋白的蛋白质与糖发生了反应，使亚基谱带颜色变浅，并形成蛋白质-糖共聚物，聚集在浓缩胶与分离胶接缝处及浓缩胶顶部。由红外光谱测得，改性后的芸豆蛋白比芸豆蛋白的α-螺旋结构、β-折叠结构多，β-转角结构、无规则卷曲少，说明芸豆蛋白与氨基葡萄糖发生了接枝反应，改变了其结构，对芸豆蛋白二级结构主链有影响。