邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯对小鼠睾丸损伤及p-CREB蛋白表达的影响

薄存香，张 玉，白 金，韩 茹，陈尚雅，赛林霖*

(山东省职业卫生与职业病防治研究院，山东第一医科大学/山东省医学科学院，山东 济南 250014)

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]属于邻苯二甲酸酯类(phthalate esters，PAEs)化合物，是常用的塑化剂，因DEHP与塑料间是氢键或范德华力结合，易于扩散至周围环境造成污染[1]。DEHP是一种典型的环境内分泌干扰物(environmentalendocrinedisruptors，EEDs)[2]，具有拟雌激素或抗雄激素作用[3-4]，可引起雄性动物生殖内分泌激素紊乱、睾丸萎缩、生精障碍等[5]，环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein，CREB)信号通路是与精子发生密切相关的途径之一[6]。本研究采用青春期雄性小鼠染毒DEHP，观察其对睾丸的损伤及对睾丸组织中p-CREB蛋白表达的影响，探讨DEHP的睾丸毒性及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

DEHP(国药集团化学试剂有限公司)，纯度≥99.0%，溶剂为玉米油。p-CREB抗体购自美国CST公司，羊抗鼠IgG及DAB购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HM325轮转式切片机(Thermo)，YT-7FB摊烤片机、2T-12M组织脱水机、YT-6LF石蜡包埋机均购自湖北亚光医用电子技术有限公司。OLYSIABioreport图像拍摄系统，购于日本奥林巴斯公司。

1.2 实验动物及处理

选择初断乳雄性ICR小鼠40只，体质量16～18 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号SCXK(鲁)20140007。按体质量随机分为对照组(等体积玉米油)和DEHP染毒组(250、500、1000 mg/kg)，每组10只。经口灌胃，1次/天，6次/周，连续灌胃染毒8周，于末次染毒24h后处死。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 一般状况观察 每天观察小鼠进食、饮水、行为活动、尿液、粪便等有无异常，每周称量小鼠体质量一次。

1.3.2 睾丸、附睾脏器系数 分别处死各组小鼠后，迅速分离收集双侧睾丸和附睾，并按下式计算睾丸和附睾脏器系数。

1.3.3 精子计数 取各组小鼠双侧附睾尾称取质量后，在4mL37℃生理盐水中剪碎，4层擦镜纸过滤，制成精子悬液，用血细胞计数板计数精子数。

1.3.4 睾丸组织病理学检查 各组随机选取3只小鼠的睾丸，以4%多聚甲醛溶液固定，常规病理切片，光镜下观察睾丸组织形态学变化。

1.3.5 免疫组织化学SP法检测睾丸组织中p-CREB蛋白的表达 主要操作步骤如下：睾丸组织石蜡切片常规脱蜡水化，3%H2O2室温封闭5～10min，置于0.01%枸橼酸盐缓冲液中微波抗原修复10min，5%～10%免疫血清封闭30min，加一抗(均为1∶100稀释)置于37℃、1h后4℃过夜，HRP标记二抗(37℃、45min)，加SP(37℃、45min)，DAB显色，上述各步之间均以0.01mol/LPBS洗3次，每次5min，最后胞核复染、脱水、透明、封片。用0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组化结果判断[7]：阳性表达的细胞被染成棕黄色，阴性表达的细胞不显色。结果判定按染色细胞的数量比和染色深度进行半定量测定。显微镜下(400倍)对每例标本均随机观察5个曲细精管，结果根据染色程度及染色细胞百分率进行评定，不着色为0分，基本不着色为1分，着色淡为2分，着色深为3分。无着色细胞为0分，着色细胞占计数细胞＜1/3为1分，≥1/3～2/3为2分，≥2/3为3分。判定结果：两者相加除以2，0分为阴性(-)，＜1为弱阳性(+)，≥1～2为中等阳性(++)，≥2～3分为强阳性(+++)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 DEHP染毒对小鼠体质量的影响

DEHP染毒后，500、1000mg/kg剂量组各有1只小鼠于给药后第6周出现会阴部污秽，于4～6d后恢复正常，其他小鼠未见明显异常症状；给药后第1周1000mg/kg剂量组小鼠体质量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 DEHP染毒对小鼠睾丸、附睾脏器系数及精子计数的影响

随着染毒剂量增加，睾丸和附睾质量下降，3个染毒组附睾系数和1000mg/kg组睾丸系数均显著低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。各染毒组精子计数均较对照组明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 DEHP染毒对小鼠睾丸、附睾脏器系数及精子计数的影响(n=10，)

表1 DEHP染毒对小鼠睾丸、附睾脏器系数及精子计数的影响(n=10，)

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2.3 DEHP染毒小鼠睾丸组织形态学改变

对照组睾丸生精上皮排列整齐，形态结构完整，管腔中无脱落细胞，可见大量精子生成，支持细胞和间质细胞数量和结构均正常；250mg/kg组光镜下发现局部生精上皮排列疏松、紊乱、层次减少。500、1000mg/kg组曲细精管上皮细胞排列疏松、紊乱、层次减少，管腔内有成团脱落的上皮细胞(见图1)。

图1 各组小鼠睾丸组织病理检查结果(×200)

2.4 睾丸组织中p-CREB蛋白的表达

免疫组化染色结果显示，小鼠睾丸组织中p-CREB蛋白主要在圆形和长形精子细胞中表达，阳性产物主要位于胞核，精原细胞和精母细胞呈阴性表达，而在Sertoli细胞、管周细胞和间质细胞包括Leydig细胞中呈散在弱阳性表达(见图2)。

图2 DEHP染毒小鼠睾丸组织中p-CREB蛋白的表达(×400)

随着DEHP染毒剂量增加，小鼠睾丸组织中p-CREB蛋白表达减弱，阳性细胞数减少，p-CREB蛋白表达评分降低，DEHP500和1000mg/kg组较对照组差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)。

表2 DEHP对睾丸组织中p-CREB蛋白表达的影响

3 讨论

DEHP是目前全球使用最为广泛的邻苯二甲酸酯类塑料增塑剂之一。释放到环境中的DEHP可经消化道、呼吸道等途径进入机体，其毒性作用主要表现在生殖毒性、胚胎发育毒性、免疫毒性、遗传毒性、神经毒性等方面。研究表明，DEHP对雄性生殖系统的损害主要表现为睾丸毒性[8]。曲莉等[9]分别以250、500和1000mg/kgDEHP灌胃染毒成年雄性小鼠，每天1次，连续4周后发现，随着DEHP剂量的升高，雄性小鼠睾丸与附睾质量及其脏器系数、精子计数呈下降趋势，精子畸形率呈上升趋势。在相同的DEHP暴露剂量下，幼龄动物的敏感性更强，本研究选择初断乳的雄性小鼠进行了8周的DEHP染毒，结果显示，DEHP各染毒组附睾系数及精子计数均低于对照组，1000mg/kg组睾丸脏器系数低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；各染毒组小鼠睾丸生精上皮出现排列紊乱、层数减少、脱落等不同程度损伤。

细胞凋亡是发生在多细胞生物体中的一个调节过程。Sun等[10]研究发现DEHP可通过上调睾丸组织中Caspase-3、Caspase-8、Bax的蛋白水平，降低睾丸组织Bcl-2表达诱导睾丸组织凋亡。本研究各染毒组睾丸组织出现生精上皮细胞脱落可能与DEHP引起生精细胞凋亡有关。

cAMP/CREB信号通路参与精子的发生、运动、获能等过程。cAMP与PKA的调节亚基结合导致催化亚基的释放，并转位至细胞核，使CREB在Ser133发生磷酸化。磷酸化的CREB结合到靶基因的特定序列cAMP反应元件，从而调节下游靶基因(睾丸组织所特有或参与精子发生的基因)的转录[6]，CREB的磷酸化是该通路的关键。Sheng等[11]研究发现CREB的磷酸化可导致小鼠精原细胞和人精原细胞瘤细胞大量增殖。有研究[12]报道CREB基因缺失、蛋白表达下调或蛋白磷酸化异常，均可导致生精细胞凋亡和坏死增加、精子生成减少，和减数分裂特有基因的表达下调。小鼠生精上皮发育根据形态学特征分为12个阶段[13]，自生精上皮基底部至腔面，依次有精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。本研究结果显示DEHP染毒后小鼠睾丸p-CREB主要在精子细胞表达，提示该信号通路在减数分裂后精子发生过程中可能发挥重要作用。p-CREB蛋白表达水平与精子数量和精子存活率呈正相关[14]，本研究DEHP各染毒组小鼠精子数量减少，DEHP500和1000 mg/kg组小鼠睾丸组织中p-CREB蛋白出现下调，提示DEHP染毒组小鼠生精数量减少可能与DEHP抑制CREB蛋白激酶磷酸化有关。

DEHP能导致肾脏损伤[15]，本研究DEHP500和1000mg/kg组小鼠出现会阴部污秽是否DEHP也可损伤泌尿系统或由其他部位引起还需进一步研究。DEHP致睾丸组织p-CREB表达下调的机制尚不明确，是否与DEHP引起cAMP含量减少[16]，或CREB磷酸化激酶如cAMP依赖蛋白激酶A、Ca2+/钙调素依赖蛋白激酶Ⅳ等活性下降等有关[17]，尚需进一步研究。