2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑对小鼠细胞免疫功能的影响

段骁骁，肖倩倩，魏雪涛，郝卫东*

(北京大学公共卫生学院毒理学系/食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

焦糖色，又名焦糖、焦糖色素，是糖类物质在高温下脱水、分解、聚合而成的红褐色或黑褐色混合型化合物，是我国允许在食品中使用的最重要天然色素之一，其产销量占到天然色素的80%以上[1-2]，广泛用于酱油、醋、啤酒、调味料等食品中。焦糖色按照使用添加剂的不同可分为普通法生产的I类焦糖色，加亚硫酸盐生产的II类焦糖色，加氨生产的III类焦糖色和亚硫酸氨法生产的IV类焦糖色，其中IV类焦糖色使用率最高，其次为III类。2-乙酰基-4-羟基-丁基咪 唑 (2-Acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole， THI)是III类焦糖色生产、加工过程中的主要副产物，因其在动物实验中表现出免疫毒性而受到广泛关注。研究表明，大鼠摄入III类焦糖色后约1/3的有色物质被吸收[3]，其经口半数致死剂量(LD50)高于17500mg/kg[4]，长期摄入可导致大鼠外周血中淋巴细胞数显著减少，同时抑制大鼠特异性和非特异性免疫功能[5-8]。Sinkeidam等[5]发现III类焦糖色对大鼠免疫系统的影响是由THI导致的，Gobin等[8]进一步证实，单独摄入THI可影响多项大鼠免疫功能指标，如胸腺淋巴细胞数显著增加，T细胞增殖能力降低和NK细胞活性下降等。Gugasyan等[9]发现单独摄入THI可以抑制小鼠的接触性超敏反应，并引起外周血中淋巴细胞的减少，而补充维生素B6可在不同程度上缓解THI引起的淋巴细胞减少症[10-11]，目前尚无THI遗传毒性和致癌性的报道[12]。因THI可导致啮齿类动物出现可逆性的淋巴细胞减少症，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)将III类焦糖色的每日允许摄入量(acceptable dailyintake，ADI)定为200mg/kg，THI限量25mg/kg。因Maekawa等[13]提出THI在大鼠体内的无可见有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel，NOAEL)为20g/kg，欧洲食品安全局(EFSA)据此将III类焦糖色的ADI下调为100mg/kg，THI限量10mg/kg。

鉴于焦糖色在我国食品生产加工过程中应用广泛，公众对焦糖色及其副产物健康风险的关注度不断增加，因此国家卫生和计划生育委员会在2017年对中国居民膳食焦糖色暴露风险进行了专项评估，在该过程中发现，THI相关的毒理学资料十分陈旧，研究内容有限且研究结果不一，不能针对敏感的毒性效应终点获得可靠的毒理学数据，难以满足对其开展健康风险评估的需求。为弥补相关毒理学资料的空缺，同时为开展THI健康风险评估提供毒理学数据，本实验研究了7d和30d连续暴露THI对小鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c雌鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部。6～8周龄，体质量18～22g，饲养于屏障环境，温度20～25℃，相对湿度40%～70%，12h/12h明暗交替循环，饲料为符合国家标准的普通维持饲料，无菌垫料，饮用水经过滤除菌处理，动物自由饮水和摄食。动物实验符合北京大学动物福利和管理委员会的相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(THI)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养液购自美国Hyclone公司；流式抗体 anti-mouseCD3FITC、anti-mouseCD4PE/CyTM5、anti-mouseCD8PE/Cyanine7购自北京达科为生物技术有限公司。

全自动血球计数仪购于日本NIHONKOHDEN公司；流式细胞仪购于美国Beckman公司；多功能酶标仪购于德国Omega公司；低温高速离心机购于德国Heraeus公司。

1.3 分组与处理

将小鼠按体质量随机分为对照组(超纯水组)和THI低、中、高剂量组，每组12只。按染毒周期分为7d和30d实验组，连续每天灌胃给药，灌胃量均按20 μL/g。7d染毒剂量为0、0.5、2.5、12.5mg/kg，30d为0、0.2、0.5、2.5mg/kg。小鼠麻醉后摘除眼球取血，颈椎脱臼处死动物，进行相关指标检测。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 外周血白细胞分类计数 眼球取血于抗凝管内，全自动血球计数仪计数白细胞总数；制备血涂片，瑞氏染液进行染色，镜下计数200个白细胞。

1.4.2 胸腺T细胞分类计数 分离胸腺于PBS，研磨至单细胞悬液；细胞计数后转移至5mL流式管中(每管1×106个细胞)，PBS洗涤一次(4 ℃、350g/min，离心5min)；弃上清，用100μL流式染色液重悬细胞沉淀，加入细胞表面分子抗体CD3、CD4和CD8混合液，混匀后4℃避光孵育30min；孵育结束，加入2 mL流式染色液洗涤一次(4℃、350g/min离心5 min)；弃上清，样品用300μL流式染色液重悬，立即采用流式细胞仪进行T细胞分类检测。

1.4.3 T淋巴细胞增殖功能测定 无菌条件下分离脾脏于 Hanks液，研磨至单细胞悬液；转移至15mL离心管，Hanks液洗涤一次(350g/min，5min)；弃上清，重悬于2mLRPMI-1640完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数(活细胞应在95%以上)，并调整细胞浓度至2×106/mL；每份细胞悬液分2孔加入24孔板中(1mL/孔)，其中一孔加入50μLConA液(终浓度为5μg/mL)，另一孔作为对照，培养72h；培养结束前4h，每孔弃去培养液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL，50μL/孔)；培养结束后每孔加入1mL酸性异丙醇，混匀后分装到96孔板中，每孔分装3个平行样，用多功能酶标仪检测，结果以波长570nm处的光密度值表示。

1.4.4 NK细胞活性实验 实验前72h将YAC-1细胞(靶细胞)传代培养，实验中用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×105/mL；无菌条件下分离小鼠脾脏于Hanks液，研磨至单细胞悬液；转移至15mL离心管，Hanks液洗涤一次(350g/min，5min)；弃上清，重悬于2mLRPMI-1640完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数(活细胞应在95%以上)，并调整细胞浓度至5×106/mL；取靶细胞和效应细胞各100μL加入U型96孔板中，同时设靶细胞自然释放孔(靶细胞和培养液各100μL)、靶细胞最大释放孔(靶细胞和5%TritonX-100各100μL)，培养4h；培养结束后，1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔板，加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，测定D(490)值，按下式计算NK细胞活性：

1.4.5 T细胞趋化功能检测 无菌条件分离脾脏于PBS中，研磨至单细胞悬液，PBS洗涤一次(4℃，350g/min，离心5min)；弃上清，重悬于RPMI-1640完全培养液中，调整细胞浓度为8×106/mL，加至96孔Transwell趋化小室上室(25μL/孔)，将含不同浓度1-磷酸鞘氨醇(S1P)的相同培养基用于下室(29μL/孔)；培养1h后，收集下室内容物于EP管内，350g/min离心5min；将细胞沉淀重悬于流式染色液中，进行抗体染色，具体过程同1.4.2。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Dunnett'sT3检验，两组均数之间比较采用t检验，方差不齐时采用t检验，数据表达方式为。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 THI对小鼠体质量和脏器质量的影响

THI对BALB/c小鼠体质量和脏器质量的影响如图1所示。7d和30dTHI连续染毒结束时，染毒组小鼠体质量、肝、胸腺、双侧腹股沟淋巴结和浅表淋巴结(颌下、腋下和腹股沟淋巴结)质量与对照组相比均未出现明显变化(P＞0.05)，仅连续染毒30d时高剂量组(2.5mg/kg)小鼠脾脏质量明显下降(P＜0.05)。

图1 THI对小鼠体质量和脏器质量的影响(n=12)

2.2 THI对外周血白细胞数的影响

THI染毒7d对小鼠外周血白细胞数的影响如图2所示。与对照组相比，THI2.5和12.5mg/kg剂量组白细胞总数均明显降低(P＜0.05)；12.5mg/kg剂量组淋巴细胞数明显降低(P＜0.05)；2.5和12.5mg/kg剂量组淋巴细胞占白细胞总数比值下降(P＜0.05)。

图2 THI染毒7d对小鼠外周血白细胞数的影响(n=12)

THI30d染毒小鼠外周血白细胞数变化情况如图3所示。与对照组相比，THI0.5和2.5mg/kg组白细胞总数明显降低(P＜0.05)，2.5mg/kg组淋巴细胞数显著下降(P＜0.05)，淋巴细胞占白细胞数比值、单核细胞数、中性粒细胞数在各剂量组中未观察到明显变化(P＞0.05)。THI染毒7d和30d各组的红细胞数均在正常值范围内。

图3 THI染毒30d对小鼠外周血白细胞数影响(n=12)

2.3 THI对胸腺T细胞数的影响

THI染毒7d小鼠胸腺细胞数的变化结果如图4所示。与对照组相比，12.5mg/kg剂量组胸腺细胞总数和T细胞数显著升高(P＜0.05)，0.5和2.5mg/kg剂量组变化不大，T细胞占胸腺细胞总数比例在各组中基本保持一致。T细胞数升高主要是由于单阳性T细胞(CD4+和CD8+T细胞)数增加所致，2.5和12.5mg/kg剂量组单阳性T细胞数显著升高(P＜0.05)，双阳性T细胞(CD4+CD8+T细胞)和双阴性T细胞(CD4+CD8+T细胞)数在各组间差异不明显，具体见表1。

图4 THI染毒7d对小鼠胸腺细胞数的影响(n=12)

表1 THI染毒7d对T淋巴细胞不同亚群细胞数的影响(×109/L，n=12)

如图5所示，THI染毒30d，与对照组相比，2.5 mg/kg组胸腺细胞数和T细胞数显著性升高(P＜0.05)。2.5mg/kg组CD4+T细胞和CD8+T细胞明显升高(P＜0.05)，0.5mg/kg剂量组CD4+T细胞数明显升高(P＜0.05)，但CD8+T细胞数未观察到明显变化。见表2。

图5 THI染毒30d对小鼠胸腺细胞数的影响(n=12)

表2 THI染毒30d对T淋巴细胞不同亚群细胞数的影响(×109/L，n=12)

2.4 THI对T细胞增殖功能的影响

如图6所示，与对照组相比，THI染毒7d仅在12.5mg/kg剂量组表现出对T细胞增殖功能的抑制，THI染毒30d，0.5和2.5mg/kg剂量组T细胞增殖功能均明显降低(P＜0.05)。

图6 THI对小鼠T细胞增殖功能的影响(n=12)

2.5 THI对NK细胞活性的影响

如图7所示，与对照组相比，THI染毒7d和30d后，均在2.5mg/kg剂量组观察到NK细胞活性明显降低(P＜0.05)；0.5mg/kg剂量组仅在30d染毒中表现出对NK细胞活性的影响(P＜0.05)。

图7 THI对小鼠NK细胞活性的影响(n=12)

2.6 THI对T细胞趋化功能的影响

如图8所示，THI染毒7d，与对照组相比，在1 nmol/L的S1P处理组，CD4+T和CD8+T细胞均在12.5 mg/kg时出现对S1P趋化功能的明显降低(P＜0.05)，CD8+T细胞在2.5mg/kg剂量组也出现该功能的降低(P＜0.05)。10nmol/L的S1P对CD4+和CD8+T细胞的趋化诱导作用最为明显，两种细胞在2.5和12.5mg/kg剂量组均出现趋化功能的明显降低(P＜0.05)；0.5mg/kg剂量组CD8+T细胞也表现出趋化功能的下降(P＜0.05)。在100nmol/L浓度的S1P处理组，CD4+T细胞2.5和12.5mg/kg剂量组趋化功能受到抑制(P＜0.05)，而CD8+T细胞仅在12.5mg/kg剂量组出现趋化功能抑制(P＜0.05)。

图8 THI染毒7d对T细胞趋化功能的影响(n=6)

如图9所示，在30d染毒实验中，与对照组相比，1和10nmol/L浓度S1P处理组，0.5和2.5mg/kg剂量组CD4+T细胞和CD8+T细胞的趋化功能均明显降低(P＜0.05)；100nmol/LS1P浓度处理组，0.5和2.5 mg/kg剂量组CD4+T细胞趋化功能明显受到抑制(P＜0.05)，但CD8+T细胞仅在2.5mg/kg剂量组表现出趋化功能的降低(P＜0.05)，0.5mg/kg剂量组未观察到该功能的明显改变。

图9 THI染毒30d对T细胞趋化功能的影响(n=6)

3 讨论

THI作为III类焦糖色生产加工过程中的主要副产物之一，因其在动物体内具有免疫毒性而得到广泛关注，但有关THI的毒理学研究，年代久远，资料陈旧，数据缺失严重，结果缺乏统一标准，且受限于实验方法和技术，评价内容和手段有限，不能针对敏感的毒性效应终点得到可靠的毒理学数据；研究对象较为单一，多数亚急性毒性实验和亚慢性毒性实验的研究对象均为大鼠，以小鼠为受试动物开展的相关研究较少。鉴于我国对于开展THI健康风险评估的迫切需要，本实验选用BALB/c雌鼠作为研究对象，运用多种敏感的免疫功能评价方法，从多个方面全面地、系统地评价了THI的对小鼠免疫功能的影响，包括非特异性免疫功能和特异性免疫功能，初步得到小鼠THI连续染毒30d的NOAEL水平为0.2mg/kg，对于开展THI风险评估具有重要的参考价值。

因多数研究指出，THI的免疫毒作用在啮齿类动物中不会表现出性别差异[13-15]，故本实验选用单一性别小鼠作为研究对象。7d染毒实验剂量设置时，综合考虑III类焦糖色和THI在人群中的实际可能暴露水平[我国III类焦糖色平均摄入量约为33.71mg/(kg·d)，其中THI平均摄入量约为24.12mg/(kg·d)]、JECFA和EFSA对于III类焦糖色中THI的限量规定以及对历史文献相关毒理学数据进行换算等多个方面，最终确定剂量梯度为0、0.5、2.5和12.5mg/kg。THI7d染毒的研究结果显示，THI表现出剂量反应关系和免疫抑制作用，2.5mg/kg剂量组在多项检测指标上已出现明显改变，同时0.5mg/kg剂量组在部分指标上已出现剂量相关的轻微变化，虽然差异不具有统计学意义。考虑到THI30d连续染毒实验更长的暴露周期，并以获得小鼠30d暴露的NOAEL水平为研究目的，故将30d染毒实验的剂量调整为0、0.2、0.5和2.5mg/kg。

研究结果显示，THI连续暴露7d和30d均不会改变小鼠体质量、摄食量和饮水量，也不会影响小鼠胸腺、肝、浅表淋巴结的质量和脏器系数。因7d染毒实验中未发现THI对双侧腹股沟淋巴结质量的影响，故在30d染毒实验中摘取了小鼠双侧腹股沟淋巴结、颌下淋巴结和腋下淋巴结，但均未在实验中观察到THI对这3类浅表淋巴结质量的影响。但值得注意的是，THI30d染毒在2.5mg/kg剂量组观察到脾脏质量的明显降低，而7d染毒2.5mg/kg剂量组及更高的12.5mg/kg剂量组均为未观察到脾脏质量的明显变化。

研究结果显示，THI在小鼠体内可引起血中白细胞数显著减少和胸腺细胞数显著增加。7d和30d染毒中，红细胞数、中性粒细胞数、单核细胞数等均未观察到明显变化，淋巴细胞变化情况与白细胞一致，且所占比例在各组基本保持不变，可认为外周血中白细胞数的减少是由于淋巴细胞数减少所引起的，而胸腺细胞总数的升高是由于T细胞数明显增加导致的。两次实验中胸腺细胞总数变化情况与T细胞变化情况均保持一致，且T细胞占胸腺细胞总数比值在各组间基本保持一致。同时还观察到THI可对胸腺T细胞亚群细胞数产生明显影响。THI染毒7d，2.5和12.5 mg/kg剂量组的单阳性T细胞(CD4+和CD8+)数均显著性升高，双阳性(CD4+CD8+)和双阴性(CD4-D8-)T细胞数基本保持不变，而THI30d染毒2.5mg/kg剂量组单阳性T细胞数也出现明显升高，0.5mg/kg剂量组仅出现CD4+T细胞数的升高，CD8+T细胞数未观察到明显变化。以上实验结果提示THI可能影响T细胞阳性选择过程或影响T细胞凋亡，但已有研究指出THI不会改变胸腺中T细胞凋亡比率[16]，故THI是否作用于T细胞分化成熟过程有待进一步的研究。

在THI对免疫功能影响方面，7d染毒仅在12.5 mg/kg剂量组出现T细胞增殖功能的明显降低，而30 d染毒的0.5和2.5mg/kg剂量组均出现T细胞增殖功能受损，两次实验脾中T细胞数各剂量组与对照组相比未出现明显差异，说明THI可以抑制单个T细胞的增殖功能。THI染毒7d的2.5和12.5mg/kg剂量组出现NK细胞活性的降低，0.5mg/kg剂量组未观察到该现象，而30d染毒的0.5和2.5mg/kg均表现出NK细胞活性的明显降低。趋化性功能研究中，连续染毒7d和30d，CD4+和CD8+T细胞均对10nmol/L浓度的S1P处理表现出最强的趋化能力，同时该条件在THI作用下，两种细胞趋化功能受损程度最大。7d染毒2.5和12.5mg/kg剂量组CD4+T细胞在10和100nmol/L S1P浓度处出现趋化功能降低，仅12.5mg/kg剂量组在1nmol/L浓度处理下细胞出现功能受损，而2.5和12.5mg/kg剂量组的CD8+T细胞在1和10nmol/LS1P浓度处理条件下均出现趋化功能降低，100nmol/L浓度处理组该细胞功能的降低仅在12.5mg/kg剂量组出现，说明CD8+T细胞对低浓度S1P的趋化功能在THI连续染毒7d条件下更易受到影响，而CD4+T细胞对较高浓度S1P的趋化功能改变更易在THI连续染毒7d条件下出现。30d染毒实验中，0.5和2.5mg/kg剂量组CD4+T细胞在3种浓度S1P条件下均出现趋化功能明显降低，CD8+T在1和10nmol/LS1P浓度处理下出现趋化功能受损，100nmol/LS1P处理下功能的降低仅在2.5mg/kg剂量组出现。研究结果显示，CD4+T细胞和CD8+T细胞针对不同浓度S1P的趋化功能，受到THI染毒剂量和染毒周期的影响，本实验为进一步开展THI相关研究时设置的染毒剂量、染毒时间和设置的S1P浓度条件，合理选择细胞类型提供了依据。

从THI连续染毒7d和30d实验结果来看，THI可以抑制小鼠的细胞免疫功能，引起血液淋巴细胞减少，胸腺中单阳性T细胞增加、T细胞趋化功能受损等。染毒剂量为0.5mg/kg条件下，当染毒时间从7d延长至30d时，会表现出7d染毒实验中未出现的免疫抑制作用，说明THI的毒性作用具有剂量和时间依赖性。在本研究中，THI连续染毒30d，0.2mg/kg剂量组未出现明显毒性作用，且有研究表明，略高于0.2mg/kg剂量THI连续染毒30d不会引起小鼠胸腺组织病理样改变[17-19]，可初步认为0.2mg/kg是小鼠THI连续暴露30d的NOAEL水平，但是否是小鼠THI作用的安全剂量，还需要更长染毒时间的毒性研究进一步确认。