异丙酚对卵巢癌SKOV3细胞克隆形成、侵袭、EMT和miR-143表达的影响

田文珺，刘士佳，刘晓明，吴 越

大连医科大学附属第一医院麻醉科 辽宁大连 116000

异丙酚化学名2,6-二异丙基苯酚，是麻醉诱导、麻醉维持和重症监护室镇静常用的静脉用麻醉药物。越来越多的研究[1-3]证实，异丙酚具有抑制肺癌、肝癌和胰腺癌等肿瘤细胞恶性增殖和转移的作用。微小RNAs(miRNAs)是一类与细胞生物学行为关系密切的非编码RNA，miR-143是miRNAs中的重要成员，被证实在乳腺癌、食管癌和骨肉瘤等肿瘤中可通过调控细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)等功能，发挥抑癌基因的作用[4-6]。已有研究[7-8]指出异丙酚可通过上调miR-143表达抑制骨肉瘤MG63细胞增殖和侵袭。本研究通过观察异丙酚对卵巢癌SKOV3细胞克隆形成、侵袭、EMT和miR-143表达的影响，探讨异丙酚与卵巢癌细胞转移的关系和可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1研究对象SKOV3细胞株(美国ATCC公司)，miR-143抑制剂及其阴性对照(广州瑞博生物公司)，异丙酚(美国Sigma公司)，Trizol试剂、Lipofectamine 2000和反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，RPMI 1640培养基、 胎牛血清、青霉素、链霉素(美国Gibco公司)，兔抗人 E-cadherin和Vimentin 单克隆抗体(武汉三鹰生物公司)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，HRP标记山羊抗兔/鼠 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。PCR相关试剂(北京康为世纪生物公司)，总蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物公司)。倒置显微镜(日本Olympus公司)，7500型荧光定量PCR仪 (美国ABI公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，恒温细胞培养箱(德国 Thermo公司)。

1.2SKOV3细胞培养和处理将SKOV3细胞培养在含有体积分数10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培养基中，常规培养条件为相对湿度为95%、体积分数5%CO2和温度37 ℃。将对数生长期的SKOV3细胞以105个/mL和每孔200 μL接种至96孔细胞板上，在常规培养条件下培养过夜。分别以0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L异丙酚刺激SKOV3细胞48 h后，收集各组细胞进行后续实验，每组设3个复孔。

1.3软琼脂集落形成实验检测SKOV3细胞克隆形成能力收集各组细胞，以每组103个细胞接种至顶层含3 g/L、底层含5 g/L琼脂糖的软琼脂上，常规培养条件下培养2周后，收集各组细胞，于显微镜下观察，统计克隆形成数。以细胞数大于50作为有效克隆。以克隆形成数与接种细胞数的百分比表示克隆形成率。实验重复3次。

1.4Transwell小室实验检测SKOV3细胞侵袭能力以浓度为250 mg/L的 Matrigel溶液100 μL包被孔径为8 μm的Transwell小室上、下室间的聚碳酸酯微孔膜。各组SKOV3细胞采用无血清培养基稀释至104个/mL。在小室下室中加入含胎牛血清的培养基500 μL，上室中加入细胞悬液200 μL，置于常规条件下培养过夜。取出小室，小心拭去上室滤膜上的细胞，并以40 g/L多聚甲醛对滤膜下层细胞进行固定，结晶紫染色。显微镜下观察并统计穿膜细胞数。以选取的5个视野细胞数的均值表示侵袭细胞数。实验重复3次。

1.5Western blot检测SKOV3细胞E-cadherin和Vimentin的表达将各组SKOV3细胞参照总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白。向蛋白样品中加入2×loading buffer煮沸5 min后，以每孔60 μg上样至SDS-PAGE中进行电泳，使用转膜仪将蛋白转至PVDF膜上。室温下，以50 g/L脱脂奶粉封闭膜1 h。以PBST洗膜，加入1∶500稀释的E-cadherin和Vimentin抗体，4 ℃下孵育过夜。洗膜，室温下加入1∶1 000稀释的HRP标记山羊抗兔/鼠IgG孵育1 h。再次洗膜，滴加发光液避光显影。以β-actin为内参进行凝胶成像系统扫描分析。实验重复3次。以目的蛋白与内参灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平。

1.6实时荧光定量RT-PCR检测SKOV3细胞中miR-143的表达收集各组SKOV3细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，并用反转录试剂盒合成cDNA。其中，miR-143引物(上游：5’-CAGTGCGT GTCGTGGAG-3’，下游：5’-GCGGTGAGATGAAGCACT-3’)和内参U6引物(上游：5’-CTCAGAGCGT GGTTCTCCGTCAC-3’，下游：5’-TATAAATCTTTAC CCTGTTGGCAGT-3’)由南京金斯瑞生物公司合成。取cDNA 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR上下游引物各0.4 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和ddH2O28.8 μL配制成总体积为20 μL的PCR体系。反应条件：94 ℃预变性20 s;94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-143的相对表达量。实验重复3次。

1.7下调miR-143对异丙酚刺激的SKOV3细胞的影响将SKOV3细胞按照每孔3×105个接种至6孔细胞板上，常规条件下培养过夜，当细胞融合大于70%时，参照Lipofectamine 2000说明书分别将miR-143抑制剂及其阴性对照转至SKOV3细胞中，转染24 h后加入终浓度为10.0 μmol/L异丙酚刺激48 h。另设未经任何处理的SKOV3细胞作为对照组，只给予10.0 μmol/L异丙酚处理而未转染的SKOV3细胞作为异丙酚组。待处理结束后，收集各组细胞，采用软琼脂集落形成实验和Transwell小室实验检测细胞克隆形成能力和侵袭能力，Western blot法分别检测EMT相关E-cadherin和Vimentin蛋白的表达。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0进行分析，各组间细胞克隆形成率、侵袭细胞数、E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平、miR-143表达水平的比较使用单因素方差分析和SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1异丙酚对SKOV3细胞克隆形成和侵袭能力的影响见表1。

2.2异丙酚对SKOV3细胞E-cadherin和Vimentin表达的影响见图1和表1。

2.3异丙酚对SKOV3细胞中miR-143表达的影响见表1。

表1 各组细胞克隆形成率，侵袭细胞数，E-cadherin、Vimentin蛋白表达和miR-143表达的比较(n=3)

各指标组间两两比较，P均<0.05

1～4：分别为0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L异丙酚组

2.4下调miR-143对异丙酚处理的SKOV3细胞的影响见图2和表2。

1～4：分别为对照组、异丙酚组、miR-143阴性对照组和miR-143抑制组

图2各组细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的表达

表2 各组细胞miR-143的表达、克隆形成和侵袭能力、E-cadherin和Vimentin蛋白表达的比较(n=3)

*：与对照组比较 ,P<0.05；#：与异丙酚和miR-143阴性对照组比较，P<0.05

3 讨论

目前，麻醉药在肿瘤中的作用是有害还是有益逐渐引起人们的关注。随着研究的不断深入，常用的静脉用麻醉药物异丙酚在肿瘤中的作用逐渐被发现和了解。Yang等[9]在关于胃癌的研究中指出，异丙酚可通过上调ING3表达抑制癌细胞的体外生长和存活。Du等[10]发现，异丙酚可通过下调SOX4表达抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。Liu等[1]研究指出，异丙酚可能通过上调miR-1284抑制肺癌A549细胞的存活、迁移、侵袭和EMT过程。Sun等[11]发现，异丙酚可通过下调miR-372抑制肺癌A549细胞的生长、迁移和侵袭。以上研究证实异丙酚可通过不同的作用机制抑制肿瘤细胞恶性增殖与转移。

miR-143是一个与肿瘤发生发展关系密切的miRNA，可通过多个靶基因抑制肿瘤细胞的增殖和转移，发挥抑癌基因的作用[12]。Zhai等[13]认为异常低表达的miR-143可通过下调ERK5在乳腺癌EMT进程和肿瘤生长过程中发挥抑制作用。Lei等[14]研究发现，miR-143可通过靶向MYO6调节EMT，从而抑制胃癌细胞转移。研究[7，15]证实，miR-143在卵巢癌的发生发展过程中发挥着类似抑癌基因的作用。Ye等[8]指出，上调miR-143表达是异丙酚抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭的重要机制。尽管已有研究[16]证实，异丙酚对卵巢癌细胞生长和侵袭有一定的抑制作用，但其是否通过miR-143参与抑制癌细胞的转移尚不完全清楚，而EMT是癌细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，其中间质指标Vimentin蛋白表达升高，上皮指标E-cadherin蛋白表达降低是EMT发生重要标志。本研究以异丙酚刺激卵巢癌SKOV3细胞48 h，发现异丙酚可呈浓度依赖性地抑制SKOV3细胞克隆形成和侵袭能力，下

调Vimentin和上调E-cadherin表达，并促进miR-143表达；而转染miR-143抑制剂后，异丙酚对SKOV3细胞的上述作用明显逆转。以上结果提示，miR-143表达上调是异丙酚抑制SKOV3细胞转移的重要机制。

综上所述，异丙酚可能通过上调miR-143表达抑制卵巢癌SKOV3细胞转移，该结果为异丙酚成为卵巢癌手术治疗中的理想麻醉药提供了参考。