食管癌小鼠食管组织中IL-17信号通路相关因子mRNA的表达

郭梦醒，郑雨佳，唐 博，张 毅，黄 岚

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫和生物治疗重点实验室 郑州 450052

我国是食管癌发病大国[1-2]。食管癌的发生可能与遗传、环境及生活方式等多种因素有关，但确切的发病机制尚未阐明。越来越多的研究[3-6]表明，肿瘤微环境中的免疫细胞、成纤维细胞、结构分子和炎性细胞因子可促进食管癌的发生发展。CD4+T细胞在活化和扩增后，分化为产生不同细胞因子和效应功能的Th1、Th2和Th17细胞亚群[7]。促炎细胞因子白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)主要由Th17细胞产生，是该家族的标志性细胞因子[8]。IL-17在人类多种肿瘤中发挥重要作用，但在食管癌变中的作用仍存在争议[9]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO)是一种诱癌剂，可诱导C57BL/6J小鼠发生食管癌变[10]。本研究采用4-NQO饮水法建立小鼠原位食管癌模型，应用qRT-PCR检测小鼠食管组织中IL-17、IL-1β、IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13 mRNA的表达，探讨IL-17信号通路在食管癌发生中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要材料和试剂13只8周龄C57BL/6J雄性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；4-NQO购自美国Sigma-Aldrich公司；1，2-丙二醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；RNAiso Plus和反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；SYBR Green购自Roche公司；IL-17、IL-23、IL-1β、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。

1.2小鼠食管癌模型的建立和分组将4-NQO溶于1，2-丙二醇配制成浓度为5 g/L的液体，再用高压灭菌水将4-NQO稀释成终质量浓度为100 mg/L的溶液。将13只8周龄C57BL/6J雄性小鼠分为两组，4-NQO组(n=8)饮用含100 mg/L 4-NQO的灭菌水。对照组(n=5)饮用含1，2-丙二醇的灭菌水。每周新鲜制备诱癌剂，更换小鼠饮用水。10周后改为饮用灭菌水，继续饲养18周，每周监测小鼠体重，观察小鼠生长状况，活动状态等。

1.3食管组织病理学检查采取颈椎脱臼法处死小鼠后进行解剖，打开胸腔，迅速取出小鼠食管组织，放入体积分数4%甲醛溶液中固定，脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片后进行HE染色，光学显微镜下观察。

1.4食管组织中IL-17、IL-1β、IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13mRNA的qRT-PCR检测剪取大小适中的食管组织，加入RNAiso Plus在组织匀浆仪中破碎，从组织匀浆裂解液中提取RNA，经反转录cDNA和PCR扩增，扩增条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40个循环。引物序列见表1，以GAPDH为内参基因，以2-ΔΔCt计算出每个目的基因mRNA的相对表达量。

表1 引物名称及序列

续表1

1.5统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析，应用重复测量数据的方差分析比较两组小鼠体重变化的差异，应用两独立样本的校正t检验比较两组小鼠IL-17通路相关因子mRNA表达水平的差异，应用Pearson相关分析4-NQO组中IL-17与其通路中相关因子mRNA的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组小鼠体重变化结果见表2。

表2 两组小鼠体重变化 g

F组间=23.527,P<0.001;F时间=93.324,P<0.001;F交互=21.237,P<0.001

2.2两组小鼠食管组织病理学观察结果见图1。4-NQO组小鼠食管组织出现增生、炎症等改变，黏膜上皮增厚；细胞异型性明显，体积偏大，形状、排列均不规则，细胞极性紊乱。

2.3两组小鼠组织IL-17信号通路相关因子mRNA表达水平结果见表3。

A：对照组；B：4-NQO组

表3 两组小鼠食管组织中IL-17信号通路相关因子mRNA表达水平的比较

2.44-NQO组小鼠食管组织中IL-17与其他因子的相关关系4-NQO组小鼠食管组织中IL-17 mRNA与IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13 mRNA的表达呈正相关(r=0.918、0.909、0.725、0.924、0.941、0.940和0.943，P均<0.05)。

3 讨论

食管癌的病因和发病机制复杂，至今仍未被完全阐明。揭示食管癌发生的关键机制，有助于为患者的早期诊断与治疗提供新的靶点。作者前期的研究[11]发现IL-17通过STAT3/NFκB/Notch1信号转导通路促进非小细胞肺癌的进展，但是在食管癌中的作用尚未阐明。本研究建立小鼠原位食管癌模型，探讨IL-17信号通路相关因子在食管癌发生过程中的作用。

不同的肿瘤微环境中IL-17发挥不同的作用。研究[12]发现在敲除IL-17的小鼠中，一些肿瘤生长更快，而一些肿瘤生长更慢，提示IL-17发挥抗肿瘤作用还是促肿瘤作用与肿瘤的微环境关系密切。Dowell等[13]发现，在膀胱癌中IL-17通过上调IL-8的表达和增加中性粒细胞的招募从而发挥抗肿瘤效应。但也有研究[14]报道IL-17在原发性肝癌中高表达，推测其参与了肝癌的癌变过程。最近的研究[15]发现结肠微生物群的特定成员可促进结肠黏膜中IL-17的产生从而促进癌变发生。

L-23和IL-1β可促进Th17细胞分化及IL-17的产生，IL-17通过诱导CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9等因子的产生促进炎症和癌症的发生发展[16]。本研究结果显示IL-17 mRNA在4-NQO组小鼠食管组织中表达升高。进一步检测发现IL-23、IL-1β、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9及MMP-13 mRNA在4-NQO组小鼠食管组织中均高表达，说明IL-17信号通路在促进食管癌发生中发挥作用。本研究还发现4-NQO组小鼠食管组织中IL-17 mRNA与 CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9、MMP-13 mRNA的表达呈正相关，提示IL-17在促进食管癌变中发挥作用可能与这些细胞因子有关。肿瘤微环境中活化的树突状细胞产生IL-23和IL-1β，刺激初始的CD4+T细胞分化为Th17细胞和IL-17的产生，Th17可能参与了食管鳞癌的浸润转移过程，并与不良预后相关[17-19]。另有研究[20]报道炎性细胞因子可促进上皮细胞分泌趋化因子，招募中性粒细胞，形成正反馈产生更多趋化因子，引起更加广泛的损伤，促进肿瘤发生；微环境中的间质细胞可以通过趋化因子促进肿瘤生长和转移。S100钙结合蛋白家族在肿瘤细胞和基质细胞之间发挥作用，促进炎性肿瘤微环境的形成，从而促进原发性肿瘤生长和转移[21]。MMPs是一类分泌蛋白酶，参与组织重塑、血管生成及肿瘤侵袭和转移。MMP-9在食管癌中表达升高，与淋巴结转移和浸润深度有关[22]。

综上所述，本研究提示IL-17信号通路可能通过趋化因子的产生、炎性肿瘤微环境的形成和组织重塑，促进食管癌的发生。