上调miR-126表达对白血病K562细胞增殖及凋亡的影响

丁 倩,杨 敏

贵州省人民医院血液内科 贵阳 550002

慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是骨髓造血干细胞恶性增生形成的血液恶性肿瘤，患病率在儿童和青少年恶性肿瘤中高居第一位[1]。在过去二十年中，高效抗肿瘤药物方面的研究取得了重大进展，然而，化疗耐药及严重的毒副作用仍然制约着CML化疗[2]。分子靶向治疗CML具有明显的优势，并且对所有类型的白血病都有效[3]。因此积极探索新的治疗靶点有助于改进CML的治疗。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一组非编码小分子RNA，其在细胞生理活动中起着重要的调节作用，如细胞生长、分化、增殖和凋亡等[4]。CML患者和健康对照miRNA表达谱对比分析结果表明，一些miRNA的异常表达与CML细胞的异常增殖密切相关[5-6]。最近研究[7-9]表明，miR-126在多种癌组织中表达下调，如乳腺癌、卵巢癌和白血病。miR-126能够抑制肝癌细胞生长，诱导细胞凋亡[10]。我们研究了miR-126对人髓系白血病K562细胞增殖和凋亡的影响，并对其作用机制进行了初步探讨，以期为白血病诊断和治疗靶点的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料K562细胞购自中国科学院上海细胞库； RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Trizol试剂、M-MLV反转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix购自大连宝生物工程有限公司；miR-126 mimic及阴性对照miRNA(miR-126 NC)购自上海吉玛制药有限公司；CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PCNA抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体及二抗均购自美国Cell Signal Technology公司；ECL化学发光检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2细胞分组处理将K562细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(不含抗生素)中，置37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。每隔1～2 d根据细胞生长状态换液传代1次。选取对数生长期的K562细胞接种于96孔板中，接种密度为1×105个/mL，置37 ℃培养箱中继续培养。待细胞生长汇合达50%时，采用Lipofectamine2000将miR-126 mimic或miR-126 NC转染入细胞中，以不做任何处理的K562细胞为空白对照。转染后细胞置37 ℃培养箱中继续培养。

1.33组细胞中miR-126表达水平的检测分别收集转染48 h的各组K562细胞，按照Trizol试剂说明书提取总RNA，利用M-MLV反转录试剂盒合成cDNA，并以cDNA为模板使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行PCR。所用引物及测序均由上海生工生物工程有限公司完成。反应体系：cDNA 2 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。以U6为内参。采用2-ΔΔCt法计算miR-126相对表达水平。实验重复3次。

1.43组细胞活力的检测分别在转染24、48、72、96 h时采用MTT法检测细胞活力，每组每个时间点3个复孔。于各个时间点每孔分别加入5 g/L的MTT溶液20 μL，置37 ℃培养箱孵育4 h，除去上清液，再向每孔细胞中添加150 μL二甲基亚砜，振荡至结晶物完全溶解，使用酶标仪检测每孔在560 nm波长处的光密度(OD)值, 以3孔OD均值表示细胞活力。实验重复3次。

1.53组细胞凋亡率检测转染48 h后分别收集3组细胞，离心弃上清，加入预冷的PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心3 min,去上清，重复2次。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡率，具体操作参照试剂盒说明书。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.63组细胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表达的检测转染48 h后，分别收集3组细胞，以PBS洗涤3次，4 ℃ 12 000 ×g离心15 min，加入蛋白裂解液提取总蛋白， BCA法检测蛋白浓度。将加样缓冲液与蛋白混合，沸水浴加热使蛋白变性。每个泳道加入60 μL蛋白样品，行SDS-PAGE，以湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。将膜用含50 g/L脱脂奶粉的PBST封闭1 h。分别加入1∶500稀释的PCNA一抗、1∶800稀释的Bcl-2一抗、1∶800稀释的Bax一抗4 ℃过夜杂交，以β-actin(1∶800稀释)为内参。PBST洗膜3次，加入1∶3 000稀释的二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，以ECL发光显色，成像系统成像拍照，采用Image J软件分析目的蛋白表达水平。以目的条带和β-actin条带吸光度的比值作为目的蛋白表达水平。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。3组细胞中miR-126表达水平，细胞活力，凋亡率，PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13组K562细胞中miR-126表达水平的比较空白对照组、miR-126 NC组、miR-126 mimic组miR-126表达水平分别为(1.00±0.10)、(0.98±0.11)和(3.19±0.02)，3组miR-126表达水平差异有统计学意义(F=645.373，P<0.001);miR-126 mimic组miR-126表达水平高于miR-126 NC组和空白对照组(P<0.05)。

2.23组K562细胞活力和凋亡率的比较细胞活力和凋亡率检测结果见表1。miR-126 mimic组K562细胞活力在24、48、72、96 h均低于miR-126 NC组和空白对照组(P<0.05)，凋亡率高于miR-126 NC组和空白对照组(P<0.05)。

表1 3组K562细胞活力和凋亡率的比较

*：与空白对照组和miR-126 NC组比较，P<0.05

2.33组K562细胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表达的比较结果见图1和表2。与miR-126 NC组和空白对照组相比，miR-126 mimic组K562细胞中PCNA和Bcl-2蛋白表达水平下调，Bax蛋白表达水平上调(P<0.05)。

1、2、3：分别为空白对照组、miR-126 NC组、miR-126 mimic组

图1 Western blot法检测3组K562细胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白的表达

*：与空白对照组和miR-126 NC组比较，P<0.05

3 讨论

CML的分子靶向治疗已取得较大成效，积极探索新的治疗靶点有助于改进CML的治疗。miR-126在多种肿瘤中低表达，并且具有抑癌作用[11-12]。Chen等[13]使用miRNA微阵列方法发现，miR-126、miR-21、miR-151-3p等多种miRNA在K562细胞的微囊泡组中的表达低于健康对照组。氢醌处理通过调节miR-126的表达抑制K562细胞红系分化[14]。提示miR-126可能与CML密切相关。

本研究中，我们用miR-126 mimic转染K562细胞后，细胞中miR-126的表达水平升高，细胞活力受到抑制，凋亡率升高，细胞中PCNA和Bcl-2蛋白表达水平下调，而Bax蛋白表达水平上调。PCNA与细胞DNA合成密切相关，参与细胞增殖的启动，因其只存在于处于增殖状态的细胞中，因此其可用作反映细胞增殖状态的指标，尤其在肿瘤细胞方面[15]。Bax是Bcl-2基因家族中促凋亡基因，Bax过度表达能够拮抗Bcl-2的抑凋亡作用，导致细胞趋于死亡[16]。本研究结果表明miR-126可以促进K562细胞凋亡，抑制细胞增殖，提示miR-126可能是白血病治疗的新靶点。Gong等[17]研究发现miR-126过表达能够通过下调ERK信号通路抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成；抑制miR-126表达则可以减少细胞凋亡，增强细胞增殖和肿瘤血管生成。Wu等[18]的研究也表明，miR-126-3p可抑制卡波西肉瘤SLK细胞增殖，阻止细胞周期进程，诱导细胞凋亡，抑制细胞的侵袭，是一种肿瘤抑制因子。本研究的结果与上述文献中报道的结果一致。

总之，本研究结果表明，上调miR-126的表达可抑制K562细胞的增殖能力，诱导细胞凋亡，这一效应可能通过上调促凋亡基因Bax的表达实现。miR-126有望成为白血病治疗的新靶标。