强启动子A4促进黄色链霉菌高产放线菌素D

杨帅 刘琴 万传星

（新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300）

1 前言

放线菌素D（Actinomycin D）是上世纪40年代Waksman首次从微小链霉菌Streptomyces parvullus中分离得到的多肽类抗生素［1]，具有抗菌、抗肿瘤、抗癌和抗病毒作用［2]。目前文献报道产放线菌素D的菌株有微小链霉菌S.parvulus，哥斯达黎加链霉菌S.costaricanus，公牛链霉菌S.tauricus，灰红链霉菌S.griseoruber，抗生链霉菌S.rubiginosohelvolus，锈赤蜡黄链霉菌S.rubiginosohelvolus，黄灰链霉菌S.flavogriseusNJ-4等［3-8]。黄色链霉菌Streptomyces luteusTRM 45540是本课题组分离自新疆罗布泊土壤的放线菌，其主要次生代谢产物为放线菌素D［9]，前期命名为易变链霉菌Streptomyces mutabilisTRM 45540，后经全基因组测序和多相分类鉴定为S.luteus［10]。启动子插入或替代是提高抗生素产量的常用方法之一，如尹守亮等在龟裂链霉菌M4018宿主内利用强启动子过表达OtcR蛋白，使土霉素的产量提高到原来产量的4倍［11]；周威等用红霉素启动子(ermE*P1)替换波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前体肽合成基因btmD启动子实现了波卓霉素的产量提高［12]；陶立彬等利用PermE*启动子提高了淀粉酶产色链霉菌丰加霉素的产量［13]。本实验拟通过接合转移方法将强启动子A4随机插入整合在黄色链霉菌Streptomyces luteusTRM 45540基因组上，考察其对放线菌素D产量的影响。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒和培养基

黄色链霉菌 TRM 45540（Streptomyces luteus）菌株，由新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。

质粒pSET152和大肠杆菌Escherichia coliS17-1，均由华中农业大学刘琴博士提供。

LB培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；

ISP4培养基 (1 L)：可溶性淀粉 10 g，K2HPO41 g，MgSO4·7 H2O 1.0 g，(NH4)2SO44.0 g，CaCO31.0 g，琼脂粉 18 g，pH 7.0～ 7.5；

燕麦-豆粉培养基(1 L)：燕麦片30.0 g，大豆粉15.0 g，NaCl 19.0 g，K2HPO41.5 g，MgSO4.7H2O 2.5 g；

Modified-ISP4(1 L)：可溶性淀粉 10 g，K2HPO41.0 g，NaCl 1.0 g ，(NH4)2SO42.0 g，CaCO32.0 g，酵母提取物0.5 g，蛋白胨1 g，MgSO4.7H2O 1.0 g，无机盐溶液 1 mL/L，琼脂20 g；无机盐溶液：FeSO41 g/L，MnCl21 g/L，ZnSO41 g/L，使用前溶化后添加MgCl2至终浓度为10 mM。

2.1.2 主要仪器和试剂

仪器：洁净工作台（Air Tech型，上海博讯实业有限公司）；恒温摇床（HYG-A型，太仓市实验设备厂）；高效液相色谱仪（LC-20AT型，日本岛津公司），配有二元梯度泵和SPD-20A紫外检测器。色谱柱：C18柱（Inertsil ODS-SP 4.6 mm×250 mm，5 μm）。

试剂：阿伯拉抗生素、萘啶酮酸购自北京索莱宝科技有限公司，PCR用相关试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司，放线菌素D（纯度大于99.0%）由本实验室分离鉴定，其余试剂购自国药集团。

2.2 方法

2.2.1 大肠杆菌Escherichia coliS17-1感受态的制备及DNA转化

感受态细胞的制备：（1）挑取平板上的E.coliS17-1单菌落于5 mL LB培养基内，37℃，220 r/min，16 h；（2）将过夜培养的菌液按1%的接种量转入含50 mL LB三角瓶中，37℃，220 r/min，培养2.5 h左右，直至OD=0.6 ；（3）收集菌体，5 000 r/min，10 min；（4）加入25 mL TFBI重悬菌体，5 000 r/min，4 min，弃上清；（5）在菌体中加入2 mL TFBII重悬菌体，并分装100 μL/离心管，放于-80 ℃储存备用。

DNA的转化：从-80℃取一支100 μL感受态细胞在冰上放置5 min，加入5 μL酶连产物或2 μL质粒，继续在冰上放置30 min。37℃热激2 min或42℃热激90 s，然后在冰上放置5 min。加入1 mL LB培养基，在37℃摇床中以200 r/min培养45 min。5 000 r/min离心3 min，倒掉大部分上清，用余下的上清将沉淀悬浮。涂布加有相应抗性的平板，37℃培养箱过夜培养。

2.2.2 转化子的构建

以质粒pLQ 007+A4为模板扩增A4片段，扩增启动子A4引物序列为：

引 物 pA4up：AAAAGGATCCGACACATCCTCCAGCTGAG

引物 pA4down：AAAATCTAGAGGACCACCAGTAAGAGCTGCGA

凝胶回收A4片段，用XbaI+BamHI酶切回收A4片段，提取pSET152的质粒DNA，用XbaI+BamHI酶切质粒DNA，脱磷处理后与A4片段进行连接；然后转入E.coliS17-1感受态细胞中，形成转化子pYS001（图1）.

图1 pYS001质粒构建图谱

2.2.3 接合子的构建

将pYS001接种在10 mL LB（Apr）培养基中，37℃，16 h；转接培养了16 h的转化子，以1%的接种量接种到新鲜的LB（Apr）培养基中，37℃，培养2.5-3 h，直至OD=0.6（600 nm）；取新鲜的孢子悬液100 μL，用TSB清洗3次，5 000 r/min，4 min；完成后加入100 μL TSB悬浮，55 ℃，10 min，37 ℃，3 h；将重新转接的转化子悬液，收集2次，12 000 r/min，1 min，用 LB 清洗 3 次，5 000 r/min，4 min，加入100 μL LB，于 100 μL 的孢子悬浮液混匀，放置5 min，将共培养的产物涂布于Modified-ISP4平板中，30℃培养12～14 h；对平板进行抗生素覆盖处理，覆盖抗生素溶液配方为1 mL超纯水、25 μL Nal、25 μL Apr。置于操作台吹干后，30 ℃，培养5～7 d。一周后挑取单菌落进行纯化培养，提取接合子和TRM 45540菌株的总DNA，PCR验证A4片段是否成功导入TRM 45540体内。

2.2.4 转化子质粒的双酶切验证

将提取的转化子质粒DNA，使用HindIII和BamHI进行酶切验证，体系如下：DNA 5 μL，10×fast Didest buffer 2 μL，HindIII 1 μL，BamHI 1 μL，ddH2O 11 μL。

2.2.5 转化子和接合子PCR验证

反应体系（20 μL）：上游引物（10 μM）0.5 μL；下游引物（10 μM）0.5 μL；模版（约 30 ng/μL）0.5 μL；Buffer（10μL,含 Mg2+）2 μL；dNTPs（2.5 mM）2 μL；DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5μL；ddH2O 14 μL。

PCR反应程序：预变性，95℃，10 min；变性94 ℃，30 s；复性，58 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min。变性-复性-延伸，循环30次；终延伸72℃，10 min。

2.2.6 菌株培养发酵及前处理流程

采用ISP4培养基制备接合子菌株S.luteusTRM 45540：：pYS001和野生菌株S.luteusTRM 45540种子液，装液量150 mL/瓶、28℃、180 r/min摇床培养3天后，按4%接种量接种到燕麦-豆粉培养基中发酵，装液量150 mL/瓶、28℃、180 r/min的摇床培养7天。每隔24 h取5 mL发酵液，50℃烘干后甲醇反复提取，定容到5 mL进行高效液相色谱（HPLC）检测分析。

2.2.7 HPLC法检测放线菌素D含量［14]

放线菌素D标准品配制成浓度为10.0 mg/mL的母液，倍性稀释成系列浓度，HPLC流动相为0～40 min,10%～100%甲醇，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温35℃，检测波长为443 nm，制作标准曲线如图2。放线菌素D的标准曲线回归方程为 y=（1.687 6×10-6）x+0.038 9，方程中x是峰面积，y是放线菌素D含量，R2值为0.999 6，放线菌素D的含量与峰面积呈良好线性关系，可用于放线菌素D的含量分析。

图2 放线菌素D的HPLC标准曲线

3 结果与分析

3.1 转化子质粒双酶切验证

提取转化子pYS001质粒，利用XbaI+BamHI双酶切，酶切产物葡聚糖凝胶电泳图参见图3。由图3可知，转化子pYS001质粒中含有A4片段。

图3 转化子pYS001质粒的双酶切验证

3.2 转化子PCR产物验证

提取转化子pYS001总DNA并以其为模板，利用启动子A4（524bp）的一对引物pA4up与pA4down进行 PCR，所用 PCR条件为 94，10 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30个循环；72 ℃，10 min。将PCR产物进行葡聚糖凝胶电泳分析（参见图4），结果显示转化子pYS001的PCR产物中含有A4片段，表明转化成功。

图4 转化子pYS001 PCR产物验证

3.3 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001中启动子A4的PCR验证

对接合转移获得的接合转移子进行阿伯拉抗生素（Apr）和萘啶酮酸（Nal）筛选，获得稳定遗传的接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001，以接合子总DNA为模板，利用启动子A4（524 bp）的一对引物pA4up与pA4down进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳分析（参见图5），结果表明启动子A4成功导入接合子中并能稳定遗传。

图5 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001中启动子A4的PCR验证

3.4 接合子S.luteusTRM 45540::pYS001与野生菌株S.luteusTRM 45540发酵产物放线菌素D的比较分析

接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001和野生菌株TRM 45540经燕麦-豆粉培养基发酵7 d后进行放线菌素D的HPLC分析和含量动态检测（如图6、图7所示），接合子S.luteusTRM 45540：：pYS001发酵7d后产放线菌素D的量为821.8 mg/L，明显高于原始菌株TRM 45540放线菌素D的产量（647.6 mg/L），说明启动子A4促进了黄色链霉菌TRM 45540产放线菌素D的产量。

图6 S.luteusTRM 45540与S.luteusTRM 45540::pYS001发酵产物443nm波长下HPLC图

图7 S.luteusTRM 45540与S.luteusTRM 45540::pYS001产放线菌素D的曲线

4 讨论与结论

放线菌素D（又称更生霉素）是具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性的酯环肽类抗生素，其作用机理为嵌合于DNA双链内，抑制DNA依赖的RNA聚合酶活性，干扰细胞的转录，从而抑制mRNA合成，尽管由于其毒性较高限制了放线菌素D的使用，但放线菌素D却是治疗霍奇金病、神经母细胞瘤、绒毛膜上皮癌和横纹肌肉瘤等恶性肿瘤的特效药，还可提高肿瘤对放射治疗的敏感性，临床上有一定的需求，所以一直有放线菌素D高产菌株的报道，如灰红链霉菌Streptomyces griseoruber放线菌素D的产量为210 mg/L［15]，红树林链霉菌Stremptmeces costaricanus产量报道为 300 mg/L［16]；两株耐碱放线菌Streptomyces sindenensis放线菌素D的产量分别为120 mg/L和850 mg/L［17]，黄灰链霉菌Streptomyces flavogriseusNJ-4放线菌素D的产量最高，为960 mg/L［18]。本实验通过接合转移的策略，导入强启动子A4对TRM 45540进行分子改造，使黄色链霉菌S.luteusTRM 45540放线菌素D的产量提高到821.8 mg/L，在放线菌素D的制备上具有一定的应用潜能。