基于UPLC-MS/MS同时测定番泻叶中吡咯里西啶生物碱的含量△

陈丽华，王钧篪，乔月，王慧娟，沈连钢，廖永红，孙迪安，斯建勇

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193

吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids，PA)是一类天然的植物毒素，主要分布于菊科、豆科和紫草科等植物中[1-3]。除严重的肝毒性[4]之外，PA还具有神经毒性[5]、细胞毒性[6]以及基因毒性[7]，目前PA受到国内外学者的广泛关注。

番泻叶为豆科植物狭叶番泻CassiaangustifoliaVahl或尖叶番泻CassiaacutifoliaDelile的干燥小叶[8]，具有泻下导滞、通便利水等药理作用[9-10]。其主要含有蒽醌、黄酮、挥发油等化学成分[11]，气质联用(GC-MS)法测定番泻叶中的成分，研究结果显示，其存在少量的含氮类成分[12]。

据报道，研究人员在部分中药材及茶叶中检测出较高含量PA[13-14]，这一结果意味着PA存在于许多药用植物中，但对于其他的中药材中是否存在PA及其含量的研究仍然比较缺乏。因此，为了检测番泻叶中PA的含量，为其安全风险评估提供依据，本研究采用超声法及阳离子交换固相萃取技术[15]对番泻叶进行提取富集，并通过UPLC-MS/MS法对其PA含量进行测定。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱-G6470三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司)；TGA Q50热重分析仪(美国TA公司)；MULTI-SPE M08固相萃取装置(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；NV-15G氮气吹干仪(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；台式低速离心机(上海托莫斯科学仪器有限公司)；JR-500D液晶超声波清洗器[精锐泽祥(北京)仪器有限公司]。

1.2 试药

14个PA对照品：野百合碱(Monocrotaline，Mc)及其N-氧化物(MonocrotalineN-oxide，McNO)、欧天芥菜碱(Europine，Eu)及其N-氧化物(EuropineN-oxide，EuNO)、天芥菜碱(Heliotrine，He)及其N-氧化物(HeliotrineN-oxide，HeNO)、千里光宁碱(Senecionine，Sn)及其N-氧化物(SenecionineN-oxide，SnNO)、Intermedine(Im)及其N-oxide(ImNO)、Lycopsamine(Ly)及其N-oxide(LyNO)、克氏千里光碱(Senkirkine，Sk)、毛束草碱(Trichodesmine，Td)均购自德国PhytoLab公司(纯度≥95%)。其结构式见图1。

色谱纯甲醇、乙腈购于美国Fisher公司；色谱纯甲酸购于DIKMA科技(北京)公司；实验室所用水为屈臣氏蒸馏水；浓氨水、浓硫酸(98%)购自北京化工厂；混合型阳离子固相萃取小柱(Cleanert PCX)；Hamilton微量进样器等。

不同来源的番泻叶样本共12批，购自印度尼西亚、缅甸及中国的海南、广东、广西等地，经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定为狭叶番泻CassiaangustifoliaVahl或尖叶番泻CassiaacutifoliaDelile的干燥小叶，标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。

图1 14个PA化合物的化学结构式

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取每个PA对照品约1 mg，用乙腈溶解并定容在10 mL容量瓶中，配成质量浓度为0.1 mg·mL-1的对照品储备液，于-20 ℃密封保存。用Hamilton 微量进样器分别吸取上述14个对照品储备液100 μL到10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，摇匀，得1 mg·L-1PA混合溶液，储存于4 ℃冰箱，待用。

2.2 供试品溶液的处理

2.2.1 样品的提取 精密称取过60目筛的样品粉末2.000 0 g(±0.000 5 g)于50 mL的锥形瓶中，加95%甲醇水溶液40 mL，常温下超声提取30 min，以6000 r·min-1离心10 min，上清液转移至50 mL的烧杯中，50 ℃水浴挥干。

2.2.2 阳离子交换固相萃取小柱PCX-SPE的净化 经10 mL 0.05 mol·L-1硫酸水溶解2.2.1项中挥干的浸膏后，过PCX-SPE萃取小柱。先用5 mL甲醇平衡PCX-SPE萃取柱，5 mL 0.05 mol·L-1硫酸水活化，然后取溶解后的提取液进行上样，分别用0.05 mol·L-1硫酸水5 mL、甲醇5 mL各淋洗两次，固相萃取装置吹干，25%氨水-甲醇5 mL洗脱两次。洗脱液在50 ℃氮吹仪下吹干。

2.2.3 样品的复溶 洗脱液吹干后用甲醇-水(50∶50，V∶V)复溶，定容至2 mL容量瓶，过0.22 μm滤膜。取1.0～1.5 mL至液相小瓶以供UPLC-MS/MS分析。

2.3 色谱与质谱条件

2.3.1 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)，流动相A：0.1%甲酸-水溶液，流动相B：0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～1 min，5%～20%B；1～4 min，20%～30%B；4～5 min，30%～37%B；5～8 min，37%～50%B；8～8.5 min，50%～5%B；8.5～10 min，5%B；后运行时间：1 min。柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流速：0.4 mL·min-1。14个PA混标的多反应监测离子流图(MRM)见图2。

2.3.2 质谱条件 离子化模式：ESI/安捷伦喷射流离子聚焦离子源，正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：3500 V；喷嘴电压：500 V；干燥气流速：7 L·min-1；干燥气温度：300 ℃；雾化气压力：275.8 kPa；鞘流气温度：325 ℃；鞘流气流速：11 L·min-1。质谱优化条件参数见表1。

注：1.Mc；2.McNO；3.Eu；4.EuNO；5.He；6.HeNO；7.Sn；8.SnNO；9.Im；10.ImNO；11.Ly；12.LyNO；13.Sk；14.Td。图2 14个PA混标溶液(质量浓度为20 μg·L-1)多反应监测离子流图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系和检出限、定量限 取1 mg·L-1的PA混合对照品溶液适量，逐级稀释成1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-18个不同质量浓度的对照品溶液，按照2.3项下色谱条件测定。以对照品溶液的浓度(X)为横坐标，其色谱峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，14个PA的相关系数r均大于0.990 5，即PA在1～200 μg·L-1线性关系良好。以信噪比(S/N)大于3为检出限，S/N大于10为定量限。14个PA化合物的线性回归方程及检出限、定量限见表2。

2.4.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，记录14个PA化合物的峰面积，计算其RSD值为1.64%～3.37%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.2方法进行制备，在2.3项条件下进样测定，日内平行测定5次；连续实验3 d，每天平行测定3次。结果显示，日内精密度RSD值为1.23%～5.63%，日间精密度RSD值为2.10%～5.96%，表明稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一批次番泻叶样品6份，按2.2方法制备供试品溶液，在2.3条件下测定，计算各PA化合物的RSD值为1.56%～5.49%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率 精密称取同一批次的番泻叶供试品9份，加入高、中、低3个不同浓度的混标溶液，每个浓度按照2.2方法分别制备3份供试品溶液，在2.3条件下测定回收率，结果见表3。

表1 PA化合物的UPLC-MS/MS质谱条件优化

表2 14个PA化合物的线性回归方程及检出限、定量限 μg·L-1

表3 14个PA化合物加样回收率试验结果(n=3) %

3 番泻叶样品中PA含量测定及日摄入量分析

3.1 样品中PA含量检测结果

取12批番泻叶样品，分别按照2.2项下方法制备供试品溶液，按2.3项条件分析测定，每个批次样品重复3次，取平均值，测定结果分别见表4和图3。

表4 12批番泻叶中总PA化合物的质量分数(n=3)

图3 12批番泻叶中PA化合物的分布及其含量

3.2 番泻叶样品中PA日摄入量分析

2015版《中华人民共和国药典》中规定：番泻叶的用量为2～6 g[8]，由此计算12批番泻叶中PA的最低日摄入量为0.01～0.38 μg，最高日摄入量为0.04～1.13 μg。根据欧盟指南中PA基准数值的建议[16]，体质量为60 kg的成人单日摄入量不超过0.42 μg。基于该PA基准值，按最低用量计算，12批番泻叶药材中PA均不超过此基准值；按最高用量计算，其中5批样品中PA日摄入量超过0.42 μg，且有一个购自云南的药材超标约3倍(见图4)。

图4 12批番泻叶样品中PA化合物的日摄入量

4 讨论

本研究所建立的UPLC-MS/MS技术具有高效、快速、灵敏的特点，可用于同时检测番泻叶药材中PA成分的含量。由于PA能够在动物或人体内残留，即使含量很低，也足应引起警惕。

本实验首次检测出番泻叶中含有PA成分，主要为野百合碱及其N-氧化物、毛束草碱、欧天芥菜碱N-氧化物以及天芥菜碱N-氧化物这5种PA化合物。其中，除购自广西的样品不含McNO外，各批次药材中McNO的含量所占比例最高(缅甸药材除外)，其质量分数最高可达117.70 μg·kg-1；另外，除了购自缅甸和广西的样品，其余批次的药材均检测到含有Mc和Td；超过一半的番泻叶药材中检测出EuNO和HeNO这2种PA成分。由此推测以上5种PA成分可能是番泻叶的内源性物质。在单个样品中分别检测出少量其余的PA化合物，有可能是外源性污染。

12批番泻叶药材中，1个购自印度尼西亚、2个分别购自云南和海南的药材PA含量比较高，根据番泻叶的最高用量计算，这5个批次的药材PA最高日摄入量超过欧盟PA基准值，它们的PA总质量分数为74.56～187.97 μg·kg-1；购自广西和四川等地的PA含量则较低。结果表明，不同产地的番泻叶药材中PA含量具有较为显著的差异，因此可能要购买更多样品对其做进一步的研究分析。鉴于PA广泛存在于多种植物并且具有严重的毒性，建立番泻叶中PA检测方法及加强对番泻叶中PA含量监管非常有必要。