UPLC-LTQ-Orbitrap-MS快速识别驱虫斑鸠菊中多酚类化合物△

王加利，田婧鋆，顾娟，孙倩倩，郭晓宇，张伽妹，王春国，刘永刚*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.中日友好医院，北京 100029

菊科斑鸠菊属驱虫斑鸠菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd的成熟瘦果可供药用，有散寒止痛、驱虫、清除不正常黏液质等效用，一般常用来治疗白癜风[1]。然而如今对其所含化学成分的研究还比较薄弱，经查阅文献可知，目前其中所明确的成分仅包括黄酮类、咖啡酰奎宁酸类、倍半萜类等[2]，并且还未发现使用LC-MS技术对其中的化学成分进行分析研究的报道。在本实验中，通过研究咖啡酰奎宁酸类、黄酮类化合物的质谱裂解规律，利用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)对其乙醇提取物中的多酚类成分进行鉴定。通过对比各个化合物的精确分子质量数据和生成的碎片离子等信息，以及使用对照品比对等方法对其乙醇提取物中的化学成分进行鉴别，为驱虫斑鸠菊的药效物质研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器与装置

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-串联静电轨道场质谱仪(美国Thermo Fisher公司)，配备热喷雾离子源与Xcalibur 2.1工作站；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统；电子分析天平(德国Satorious公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 主要材料与试剂

驱虫斑鸠菊购于新疆和田市艾比布拉阿吉维吾尔医大药房，由新疆维吾尔医学专科学校木艾塔尔副教授鉴定为菊科植物驱虫斑鸠菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.的成熟瘦果。纯度大于98%的圣草酚、紫铆查尔酮、异鼠李素、硫黄菊素、木犀草素、咖啡酸和3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯都是由本实验室从驱虫斑鸠菊药材中分离得到的[3]，乙腈和甲酸(美国Thermo Fisher公司)均为质谱级。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 精确称量各对照品，加入一定量甲醇，超声溶解，配制为1 mg·L-1的混合对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取20 g驱虫斑鸠菊，加入200 mL 80%乙醇，回流1 h后真空浓缩，水浴蒸干，加适量甲醇溶解，稀释100倍，用0.22 μm的滤膜过滤，即可得。

2.2 实验条件

2.2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱温：25 ℃；流动相A和B分别为0.1%的甲酸水和乙腈，梯度洗脱程序为：0～1 min A相由98%降至85%，1～8 min A相由85%降至65%，8～9 min A相由65%降至40%，9～12 min A相由40%降至2%；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2.2 质谱条件 HESI离子源，负离子检测模式；鞘气流速：40 L·h-1，辅助气流速：20 L·h-1；离子源温度：350 ℃；毛细管电压-35 V；电离源电压-4 kV；管状透镜电压-110 V；样品采用傅里叶变换高分辨全扫描(FT)，质量扫描范围m/z为150～1500；检测分辨率为30 000；利用数据依赖性扫描获得二三级质谱，选择上一级丰度最高的3个色谱峰进行碰撞诱导解离碎片扫描。

3 结果

3.1 对照品的LC-MS分析

3.1.1 黄酮类化合物的裂解规律 5个黄酮类成分在负离子模式下的一级和二级质谱图如图1(A～E)所示。这5个黄酮类成分根据母核结构可分为黄酮、二氢黄酮、黄酮醇、查耳酮、橙酮5种类型的黄酮类衍生物。木犀草素(A)属于黄酮类化合物，准分子离子峰[M-H]-为m/z285，与此同时也生成了1，3A-m/z151，这是经RDA裂解产生的碎片离子。在二级质谱中，因为进一步的CID碎裂，产生了比较多的碎片离子，包括脱去H2O、CO、CO2、C3O2、C2H2O+CO2等中性分子形成m/z267、257、241、217、198等的碎片。圣草酚(B)属于二氢黄酮类化合物，准分子离子峰[M-H]-为m/z287，在二级质谱中又发生了RDA裂解，得到1，3A-m/z151碎片离子。异鼠李素(C)属于黄酮醇类化合物，准分子离子峰[M-H]-为m/z315，二级质谱中出现脱去-CH3(15 Da)的碎片离子m/z300。紫铆查耳酮(D)为查耳酮类化合物，准分子离子峰[M-H]-为m/z271，在二级质谱中出现的离子m/z253为其脱去H2O的碎片，且羰基发生α裂解形成m/z135的基峰。硫黄菊素(E)为橙酮类化合物，准分子离子峰[M-H]-为m/z269，二级质谱中出现脱去H2O、CO、CO2、C3O2而得到的m/z251、241、225、201碎片离子，还出现C环裂解碎片m/z135。由上述质谱裂解规律可知，黄酮类成分在负离子模式下均能发生一系列中性小分子丢失，包括H2O、CO、CO2、C3O2及其组合碎片，但是不同黄酮类型丢失中性小分子的难易程度不同，主要表现为在二级质谱中的相对丰度不同；黄酮类成分一般能够在C环内部发生包括RDA裂解在内的多种裂解，因母核的不同使其裂解优先次序也不相同；如果在黄酮母核中存在甲氧基取代，脱去甲基形成的离子是其特征碎片。以木犀草素为例的黄酮类化合物的裂解途径如图2所示。3.1.2 咖啡酰奎宁酸类化合物的裂解规律 图1(F)为负离子模式下3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯的多级质谱图。其准分子离子峰[M-H]-为m/z529；在二级质谱中脱去一分子咖啡酸，得到单咖啡酰奎宁酸甲酯m/z367；在m/z367的三级质谱中检出m/z191[quinic]-、179[caffeoyloxy]-、161[caffeoyloxy-H2O]-、135[caffeoyloxy-CO2]-碎片离子，其裂解途径如图3所示。由此我们推测，咖啡酰奎宁酸类化合物的特征离子包括m/z191、179、161、135等。

注：A.木犀草素；B.圣草酚；C.异鼠李素；D.紫铆查耳酮；E.硫黄菊素；F.3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯；MS1为一级质谱；MS2为二级质谱；MS3为三级质谱。图1 驱虫斑鸠菊中6个多酚类化合物的质谱图

图2 木犀草素的质谱裂解途径

图3 3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯的质谱裂解途径

3.2 驱虫斑鸠菊中多酚类化合物结构的快速鉴定

图4为驱虫斑鸠菊样品经UPLC-LTQ-Orbitrap分析后的典型总离子流色谱图，可看出大部分成分分离良好。在本研究中，通过查阅有关的文献、搜索一些数据库的数据，如Chemspider、Scifinder等，建立了92个斑鸠菊属已知化合物的信息数据库，包括化合物的分子式、结构式和名称。然后将该数据库中各化合物的理论质荷比导入质谱分析软件，若出现一级质谱精确质荷比与理论质荷比误差小于5的化合物，且二级质谱满足该类化合物的裂解规律及特征碎片信息，即认为它们是同一个化合物。通过此种方法，总共鉴定出43个多酚类化合物，其中包括30个黄酮类、9个咖啡酰奎宁酸类和4个酚酸类化合物，其中有26个化合物为驱虫斑鸠菊中新发现的化合物。表1罗列了UPLC-LTQ-Orbitrap-MS条件下鉴别的43个多酚类成分的保留时间、分子量、分子式和碎片离子信息。

图4 负离子模式下驱虫斑鸠菊80%乙醇水提取物的总离子流图

3.2.1 黄酮类成分分析 在本实验中所鉴别的30个黄酮类成分中，包括22个黄酮苷元和8个黄酮糖苷。在黄酮苷元的二级质谱中出现了C环发生RDA裂解的特征离子碎片，并观测到了中性丢失H2O、CO、CO2、C3O2和C2H2O的碎片，笔者再通过对照品比对或结合文献报道鉴定了这22个黄酮苷元。例如化合物28，其准分子离子峰[M-H]-为m/z269，二级质谱碎片包括m/z251[M-H-C3O2]-、241[M-H-CO]-、227[M-H-C2H2O]-、225[M-H-CO2]-、201[M-H-H2O]-、183[M-H-C2H2O-CO2]-、1511，3A-、1491，4B-+2H。以上碎片离子符合黄酮类化合物的裂解规律[4-5]，所以推断其有可能为黄酮类，通过查阅文献[6]，鉴定得此化合物为芹菜素。被鉴定的8个黄酮糖苷都为氧糖苷，在二级质谱中均出现丢失一分子脱水葡萄糖(162 Da)的碎片。

3.2.2 咖啡酰奎宁酸类成分分析 化合物3、18和21有可能是单咖啡酰奎宁酸，因为其准分子离子峰[M-H]-均为m/z353，主要的二级质谱碎片为m/z191[quinic]-、179[caffeoyloxy]-、173[quinic-H2O]-和135[caffeoyloxy-CO2]-，再通过查阅文献[7]2905鉴定化合物3、18和21分别为3-O-咖啡酰奎宁酸(3-CQA)、5-O-咖啡酰奎宁酸(5-CQA)、4-O-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)。化合物12、13、16、20有可能是二咖啡酰奎宁酸，因为其分子离子峰[M-H]-均为m/z515，再根据其主要的二级质谱碎片m/z353和单咖啡酰奎宁酸的特征离子m/z135、173、179、191等，再结合文献[7]2906鉴定化合物12、13、16、20分别为1，3-DCQA、3，4-DCQA、1，5-DCQA、3，5-DCQA。化合物27、32的分子离子峰[M-H]-都是m/z529，其主要的二级质谱碎片为m/z367，与此同时在化合物碎片中也出现了单咖啡酰奎宁酸的特征离子；而m/z367比单咖啡酰奎宁酸离子碎片m/z353多1个CH2(14 Da)，根据如上叙述，推测化合物27、32可能是甲基化二咖啡酰奎宁酸，通过比对对照品，可以确定这两个化合物分别为3，4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯和3，5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。

3.2.3 酚酸类成分分析 化合物2、4通过与对照品原儿茶酸、咖啡酸的质谱信息和保留时间比较，确定其分别为原儿茶酸、咖啡酸。化合物25的分子离子峰[M-H]-为m/z193，二级质谱碎片主要为m/z178[M-CH3]-、134[M-CO2]-，再结合文献[7]2907可以推断该化合物为咖啡酸甲酯。化合物37的分子离子峰[M-H]-为m/z207，二级质谱碎片主要为m/z179[M-C2H4]-、135[M-CO2]-，结合文献[7]2907，综合上述离子信息能判断化合物37是咖啡酸乙酯。

4 讨论

虽然在结构鉴定方面，高分辨质谱技术依然不能算是完美，但是液相色谱-质谱联用技术已经成为快速分离和鉴定中药活性成分有力手段[8-11]，且可以在比较短的时间内完成。驱虫斑鸠菊化学成分复杂，目前还不甚明确。在前期关于驱虫斑鸠菊的实验中，鉴定出14个化合物，本实验中首先对前期所得多酚类化合物的质谱裂解机制进行研究，结果发现黄酮类化合物在负离子模式下均能发生RDA裂解及一系列中性小分子(H2O、CO、CO2、C3O2)的丢失，而咖啡酰奎宁酸类化合物容易出现丢失咖啡酸、CO2、H2O等分子的特征离子峰，根据所总结的裂解规律，对驱虫斑鸠菊乙醇提取物中所含的多酚类化合物进行了快速识别，初步鉴定出30个黄酮类化合物、13个酚酸类化合物，其中有26个化合物为在驱虫斑鸠菊中新发现的化合物。本研究通过建立高通量的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS方法，识别了43个多酚类化合物，为驱虫斑鸠菊中多酚类成分的定性分析提供了一种高效且快速的分析方法。

表1 驱虫斑鸠菊中多酚类化学成分的鉴定结果

续表1

注：*表示为该植物中新发现的化合物。