基于UPLC-Q-TOF-MS 技术分析乌蕨中的化学成分*

黄斌 胡燕珍 李雪 吴先昊 王亚敏 陈乐

（江西省中医药研究院 南昌330046）

乌蕨（Odontosoria chinensis）又称乌韭、苦黄连、大叶金花草等，为陵齿蕨科，属多年生草本植物[1]，乌蕨在我国的蕴藏量极大，主要分布于长江流域附近的江西、安徽、湖南、四川、云南、广西等省。乌蕨具有保肝、清热解毒、抗炎、抗肿瘤等作用[2～3]，《江西草药》《中药大辞典》《贵州中草药名录》《广西中药志》等都记载了乌蕨可用来治疗痢疾、烫伤、支气管炎、肝炎、黄疸等疾病[4]。乌蕨尚无明确的质量标准规范，段萍等研究乌蕨地上部分质量控制方法，对多批次乌蕨药材的原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷含量进行了测定[5]。本课题组前期对乌蕨的化学成分及药理作用进行了总结[6]，同时对乌蕨抗炎活性部位进行了研究[7]。目前，超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术[8～12]已被广泛应用于化学成分的快速识别中，本实验利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术快速识别乌蕨中化学成分，建立其化学成分分析方法，为乌蕨物质基础的进一步研究提供参考依据。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 AB-Sciex5600 系列LC/MSTrap 型质谱仪，Waters C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），PeakView 1.2 软件；对照品：原儿茶酸（批号：110809-201906）、原儿茶醛（批号：110810-201608）、秦皮乙素（批号：741-200105）、香草酸（批号：776-9001）、咖啡酸（批号：885-200102）、牡荆苷（批号 ：111687-201704）、 木 犀 草 苷 （ 批 号 ：111720-201106）、槲皮苷（批号：111538-200302）、木犀草素（批号：110861-201611）、芹菜素（批号：111901-201102），以上对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度均≥95%。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Waters C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-0.2%甲酸溶液，柱温为 40℃，进样量为 2 μl，流速为 0.25 ml/min。梯度洗脱条件见表1，质谱条件见表2。

表1 梯度洗脱条件

表2 质谱条件

1.2.2 供试品和对照品溶液的制备 取粉碎后的乌蕨药材0.5 g，加入纯甲醇25 ml，超声提取，过滤并定容于25 ml 棕色容量瓶中，用孔径0.22 μm 微孔滤膜过滤即得供试品溶液。精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、秦皮乙素等对照品各0.1 mg，用甲醇溶解定容于25 ml 棕色容量瓶中，用孔径0.22 μm 微孔滤膜过滤即得对照品溶液。

2 结果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 成分鉴定 通过整理各化学成分的保留时间、质谱信息，并结合对照品、相关文献数据对比对化学成分进行了确认。见表3。用UPLC-Q-TOF-MS 对供试品及对照品进行分析，正、负离子模式TIC 图。见图1。

图1 正、负离子模式TIC 图

表3 乌蕨醇提物化学成分

2.2 根据质谱裂解特征鉴定的成分

2.2.1 有机酸类 该类化合物在负离子模式下主要以[M-H]-的准分子离子峰形式存在，在高能碰撞下易发生CO、CO2、H2O 等中性分子丢失；有机酸苷则是先脱去相应的糖，紧接着脱去CO、CO2等中性分子，文献6 也表明乌蕨中含有原儿茶酸、原儿茶醛、龙胆酸、香草酸、2-O-β-D-（6-O-龙胆酰吡喃葡萄糖）龙胆酸等化合物。原儿茶酸保留时间（tR）为3.869 min，在负离子模式下，其准分子离子峰为m/z 153[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C7H6O4，二级图谱中通过脱去 CO2、HCO2分别产生 m/z 109[M-H-CO2]-，m/z108 [M-H-HCO2]-的碎片离子峰，与对照品及文献9 比对，鉴定为原儿茶酸。原儿茶酸葡萄糖苷tR为3.508 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 315[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C13H16O9，二级图谱中通过葡萄糖，产生m/z 153 [M-H-glc]-碎片离子峰，然后脱去CO2、HCO2分 别 产 生 m/z 109 [M-H-glc-CO2]-，m/z 108[M-H-glc-HCO2]-的碎片离子峰，与文献8 比对，鉴定为原儿茶酸葡萄糖苷。2-O-β-D-（6-O-龙胆酰吡喃葡萄糖）龙胆酸tR为9.300 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 451 [M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C20H20O12，二级图谱中，发生酚苷键断裂，脱去龙胆酸的中性分子，生成m/z 297[M-H-C7H6O4]-碎片离子；再发生酯苷键断裂，脱去糖环残基，生成龙胆酸的特征离子m/z 153[M-H-C7H6O4-C6H8O4]-，脱去 CO2，生成 m/z 109[M-H-C7H6O4-C6H8O4-CO2]-的碎片离子。鉴定为2-O-β-D-（6-O-龙胆酰吡喃葡萄糖）龙胆酸。见图2。

图2 原儿茶酸、原儿茶酸葡萄糖苷、2-O-β-D-（6-O-龙胆酰葡萄糖）龙胆酸MS2 图

2.2.2 香豆素类 该类化合物负离子模式下主要以[M-H]-的准分子离子峰形式存在，发生裂解时出现连续脱去CO、CO2的碎片离子峰，如果是香豆素苷类成分，则首先脱去糖基部分。秦皮乙素tR为6.655 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 177[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C9H6O4，二级图谱中脱去一分子CO、CO2生成m/z 149[M-H-CO]-，m/z 133[M-H-CO2]-碎片离子，再脱去一分子CO 生成m/z 105[M-H-CO2-CO]-碎片离子。与对照品及文献10 比对鉴定为秦皮乙素。秦皮甲素tR为5.016 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 339[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C15H16O9，二级图谱中脱去糖基部分，生成秦皮乙素苷元离子，m/z 177[M-H-glc]-。与文献10 比对鉴定为秦皮甲素。见图3。

图3 秦皮乙素、秦皮甲素MS2 图

2.2.3 黄酮碳苷 黄酮碳苷在负离子模式下，不首先出现脱糖的离子碎片，而是发生糖环裂解，产生丢失90 u、120 u、150 u 的离子碎片；在正离子模式下，会产生连续脱去水分子的碎片离子，文献6 表明乌蕨中含有牡荆苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷等黄酮碳苷类化合物。牡荆苷tR为11.763 min，在负离子模式下，其准分子离子峰为m/z 431[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C21H20O10，发生糖环裂解，产生m/z 341[M-H-90]-，m/z 311[M-H-120]-的特征碎片离子，脱去CO 产生m/z 283[M-H-120-CO]-的碎片离子；在正离子模式下，其准分子离子峰为m/z 433[M+H]+，二级图谱中连续脱去3 个水分子生成m/z 415 [M+H-H2O]+，m/z 397 [M+H-2H2O]+，m/z 379[M+H-3H2O]+的碎片离子；发生糖环裂解，生成m/z 313[M+H-120]+，m/z 283[M+H-150]+的碎片离子。与对照品及文献13、14 比对，鉴定为牡荆苷。荭草苷tR为11.443 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 447 [M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C21H20O11，发生糖环裂解，产生m/z 357[M-H-90]-，m/z 327[M-H-120]-，m/z 297[M-H-150]-的碎片离子峰；在正离子模式下，其准分子离子峰为m/z 449[M+H]+，连续脱去 3 个水分子后生成 m/z431[M+H-H2O]+，m/z 413 [M+H-2H2O]+，m/z 395[M+H-3H2O]+的碎片离子；发生糖环裂解，生成m/z 329[M+H-120]+，m/z 299[M+H-150]+的碎片离子。与文献13、14 比对，鉴定为荭草苷。牡荆素鼠李糖苷tR为13.343 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 577 [M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C27H30O14，发生糖环裂解，产生 m/z 457[M-H-120]-碎片离子，脱去鼠李糖基，产生m/z 311[M-H-120-rha]-碎片离子；在正离子模式下，其准分子离子峰为m/z 579[M+H]+，二级图谱中脱去鼠李糖，生成m/z 433[M+H-rha]+碎片离子，其后面裂解过程同牡荆苷。与文献8 比对，鉴定为牡荆素鼠李糖苷。见图4～图5。

图4 牡荆苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷在负离子模式下的MS2 图

图5 牡荆苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷在正离子模式下的MS2 图

2.2.4 黄酮氧苷 该类化合物负离子模式下主要以[M-H]-的准分子离子峰形式存在，发生裂解时主要脱去其糖基部分，生成其苷元离子，然后发生脱羰基或发生RDA 裂解，文献6 表明乌蕨中含有芹菜素、山萘酚、芹菜素-7-O-葡萄糖苷等黄酮类化合物。芹菜素-7-O-葡萄糖苷tR为15.875 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 431[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C21H20O10，脱去葡萄糖，产生m/z 269[M-H-glc]-碎片离子，与文献12 比对鉴定为芹菜素-7-O-葡萄糖苷。芹菜素tR为28.017 min，在负离子模式下，准分子离子峰为m/z 269[M-H]-，根据元素组成分析，分子式为C15H10O5，发生RDA 裂解，产生m/z 117，m/z 151 碎片离子，与对照品及文献12 比对鉴定为芹菜素。

图7 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素的MS2 图

3 讨论

本研究通过对乌蕨甲醇提取物进行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析共推断出32 种化合物，其中有15 个有机酸类、2 个香豆素类、15 个黄酮类物质（包括2 个黄酮苷元、7 个黄酮碳苷、6 个黄酮氧苷），原儿茶酸葡萄糖苷、咖啡酰葡萄糖苷为首次从乌蕨中发现。

目前文献报道乌蕨含有的黄酮碳苷为单糖碳苷、二糖碳苷，二糖碳苷的碎裂规律鲜有文献报道，其与双糖碳苷的裂解规律差异也尚不明确[13～14]，其主要问题在于糖是与苷元连接还是与糖基连接，本文中的二糖碳苷及三糖碳苷有待进一步深入研究。文献[15～16]也表明有机酸、黄酮碳苷类成分与其抗炎、保肝等功效有关，因此有机酸、黄酮及其苷类成分是乌蕨的有效成分群，而乌蕨的药效物质基础研究有待进一步深入挖掘。