LC-IT-TOF-MSn快速鉴别沉香中2-(2-苯乙基)色酮类成分△

张倩，霍会霞，孙慧，许霞，夏晖，管朋维，王超超，李军，赵云芳

北京中医药大学 中药学院 中药现代研究中心，北京 100029

沉香为瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg 的含有树脂的木材，具有缓泻[1-2]、解痉[3]、镇静[4]、镇痛、抗炎[5]等活性。野生白木香资源匮乏，目前“通体结香技术”提高了沉香的产量，且其质量较好[6]。沉香主要含有2-(2-苯乙基)色酮类(41%)、倍半萜类(52%)和芳香族类化合物[7-8]，其中2-(2-苯乙基)色酮类仅来源于瑞香科植物，是沉香的特征性成分。该类成分由色酮环和苄基环通过CH2-CH2键相连，其取代基通常有一个或多个甲氧基或羟基。报道指出，色酮类成分对NO的生成具有明显的抑制效果[9]，具有神经保护作用[10]，对人胃癌细胞具有细胞毒性[11]。

研究发现，2-(2-苯乙基)色酮类成分的特征质谱行为是CH2-CH2键的断裂，具有取代基时，会发生中性丢失，如四羟基四氢色酮在多级碎裂过程中会丢失H2O和CO[12]。另外，在色酮类成分的质谱分析中，可以检测到卓鎓离子，通过同位素标记和理论计算可推断自由基离子的形成过程[13]。通过超临界流体色谱串联质谱可以检测到15种常见的有取代基的卓鎓离子碎片[14]。在前期研究中发现，不同类型的2-(2-苯乙基)色酮类成分具有不同的裂解规律。因此，本研究采用LC-IT-TOF-MSn对沉香中2-(2-苯乙基)色酮类成分进行分析，以期为沉香的分析和质量控制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

岛津LC-20ADXR高效液相色谱仪，离子源为ESI源的离子肼-飞行时间质谱仪(IT-TOF-MS)。质谱级乙腈、甲酸购于Thermo Fisher公司，水为超纯水，其他试剂为分析纯。沉香药材采自中国广东省，经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为瑞香科植物白木香含有树脂的木材。31个2-(2-苯乙基)色酮类对照品均为自制，经UV、IR、MS、1H NMR和13C NMR鉴定其结构，HPLC归一化法测定其纯度不低于95%，结构见图1。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 取沉香药材粉末(过三号筛)0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇10 mL，超声(500 W，40 kHz)处理30 min后放至室温。取上清液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，注入液质系统。

1.2.2 色谱方法 色谱柱为Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，0～20 min，10%～20%B；20～35 min，20%～25%B；35～55 min，25%～35%B；55～70 min，35%～38%B；70～90 min，38%～50%B；90～105 min，50%～70%B；105～120 min，70%B，120～121 min，70%～90%B，121～130 min，90%B。流速为1 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为252 nm。用2根PEEK管将液相流出液进行1∶4分流，约20%流出液进入质谱分析。质谱参数设定：正离子模式，自动多级全扫描，扫描范围为m/z100～1000，高纯氮气为雾化气和干燥气，高纯氩为冷却气和碰撞气；检测器电压1.50 kV，加热器温度，200 ℃，CDL温度，200 ℃；雾化气1.5 L·min-1；接口电压4.5 kV。

2 结果与分析

实验中对流动相、色谱柱类型、柱温、流速等进行了考察，对离子化模式、检测器电压等质谱参数进行了优化，结果见图2。

图1 31个2-(2-苯乙基)色酮类对照品

注：A.对照品总离子流图；B.沉香药材总离子流图；C.沉香药材提取离子流图。图2 沉香药材LC-IT-TOF-MSn图

2.1 2-(2-苯乙基)色酮类成分的裂解规律

采用IT-TOF-MSn对31个对照品进行分析，包括三元氧环四氢色酮(Ⅰ，19、41～42)，四羟基四氢色酮(Ⅱ，1～11)，氯代四氢色酮(Ⅲ，12和30)，简单2-(2-苯乙基)色酮(Ⅳ，26、37～38、52、56～57、62、64、66～68、71、74、77、X)。其主要裂解途径见图3，特征碎片见表1～3。

图3 2-(2-苯乙基)色酮类成分的裂解途径

2.1.1 三元氧环四氢色酮(Ⅰ) [M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰是三元氧环四氢色酮MS1的主要碎片峰，其准分子离子失去CO，可产生[M+H-CO]+和[M+H-2CO]+子离子。该类色酮的特征裂解行为即A环连续失去CO，见图 4。当B环无甲氧基取代时，可检测到微量的6A+(m/z192.040 7)碎片离子，如对照品42，但当4′-位有取代时，则未发现该离子，如对照品19和41。

2.1.2 四羟基四氢色酮(Ⅱ) 四羟基四氢色酮的特征碎片为[M+H]+和[M+H-H2O]+，特征碎片可进一步丢失18 Da(H2O)、46 Da(H2O+CO)、74 Da(H2O+2CO)，连续丢失H2O和CO为该类色酮的特征裂解途径[11]，这与之前的研究结果一致。另外，碎片峰[M+H-A ring-C ring-CH2]+(6B+ion)，即m/z91[C7H7](对照品6)、107[C7H6+OH](对照品1)、121[C7H7+OCH3](对照品7、9、11)和137[C7H7+OH+OCH3](对照品2、3、4)的存在，有助于推断取代基的类型。

CH2-CH2键断裂可形成6B+和6A+离子，但当B环4’-位无甲氧基取代时，可以明显的检测到6A+离子，如对照品1、5、6、8和10。当B环4’位-被甲氧基取代后，无法检测到6A+离子。CH2-CH2键断裂后通过中性丢失H2O和CO也可形成6A+离子，但当B环有羟基取代时，6A+离子为[M+H-2H2O-6B+H]+，如化合物1和5，B环无羟基取代时，6A+离子为[M+H-2H2O-CO-6B]+。

表1 四羟基四氢色酮对照品的质谱数据

表2 氯代四氢色酮和三元氧环四氢色酮对照品的质谱数据

表3 简单2-(2-苯乙基)色酮对照品的质谱数据

图4 对照品42的裂解途径

2.1.3 氯代四氢色酮(Ⅲ) 该类成分的特点是在质谱图中有同位素峰，同时由于氯原子的存在，失去HCl为其特征裂解行为，其裂解途径见图5。C11-C12的断裂，会形成6B+碎片，如对照品30的m/z91.052 5[C7H7]碎片峰，对照品12的m/z137.059 6[C7H7+OH+OCH3]碎片峰，该碎片峰也是氯代四氢色酮的特征裂解行为。同时，通过6B+特征碎片可以判断取代基的类型。

2.1.4 简单2-(2-苯乙基)色酮(Ⅳ) 对于简单2-(2-苯乙基)色酮，6B+碎片离子为其特征碎片。当B环有甲氧基取代时，可以检测到[6B-·CH3]+和[6B-OCH3]+碎片离子。此外，当4’-位无甲氧基取代时，可以检测到6A+碎片离子，如对照品38、56、67、74等。

该类型色酮的特征裂解方式是发生在C环的RDA裂解。如对照品X，在其MS2谱中可以检测到m/z121.028 8(1，3A+)碎片离子，其裂解途径见图6。简单2-(2-苯乙基)色酮具有相同的母核结构，羟基取代或甲氧基取代可以生成特征碎片如m/z151[C7H4O2+OCH3]、167[C7H4O2+OCH3+OH]、181[C7H4O2+2OCH3]、153[C7H4O2+2OH]，137[C7H4O2+OH]等，通过这些特征碎片，可以判断取代基的类型和数量。

图5 氯代四氢色酮的裂解途径

图6 对照品X的裂解途径

2.2 沉香中2-(2-苯乙基)色酮类成分的分离鉴别

利用上述裂解特征，对沉香药材中的2-(2-苯乙基)色酮类成分进行了分离鉴别，最终检测发现了77个色酮类成分，包括4个三元氧环四氢色酮，18个四羟基四氢色酮，4个氯代四氢色酮，51个简单2-(2-苯乙基)色酮。以下举例说明2-(2-苯乙基)色酮类成分的鉴别过程。

色谱峰31的准分子离子峰为m/z283.096 2，在其MS2谱中，可检测到m/z255.100 1、227.104 7、192.035 8和164.046 3的碎片峰。分析发现，这些碎片是分别通过丢失CO、2CO、B ring和CO+B ring 产生的。上述裂解行为与对照品42相似，见图7。因此色谱峰31鉴定为对照品42的同分异构体，为三元氧环四氢色酮。

色谱峰13、[M+H-H2O]+，[M+H-H2O-CO]+和6B+是其主要的碎片峰，同时m/z137.060 6提示B环有1个羟基和1个甲氧基，但由于未检测到6A+碎片离子，因此推断甲氧基取代基在B环的4’-位。当B环仅含有1个羟基和1个甲氧基时，四羟基四氢色酮类成分的结构同对照品2、3和4相似，其分子式为C18H20O8。色谱峰13与之相较，多18 Da(H2O)。因此推断色谱峰13的A环存在临位羟基和1个三元氧环取代，同对照品19相比，色谱峰13拥有相似的裂解途径，见图8。因此色谱峰13鉴定为5，6-epoxy-7，8-dihydroxy-2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone，为四羟基四氢色酮。

由于同位素峰的存在，色谱峰12，29，30和36鉴定为氯代四氢色酮。通过与对照品比对，色谱峰12和30进行了确证。在色谱峰29和36的质谱图中，均可检测到准分子离子峰m/z367[M+H]+、碎片离子m/z349[M+H-H2O]+和6B+。碎片峰m/z121的存在可以推断其有一个甲氧基取代基。另外，色谱峰29的碎片峰m/z331.071 5[M+H-2H2O]+和295.086 9[M+H-2H2O-HCl]+提示A环至少有两个羟基取代基。同对照品30相较，色谱峰29具有相似的碎裂途径，即-H2O、-2H2O、-2H2O-HCl，且均可检测到6B+碎片离子。因此，色谱峰29鉴定为 5，6，7-trihydroxyl-4′-methoxyl-chloro-substituted-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone，色谱峰36为其异构体。

注：A、B为一级质谱图；C、D为二级质谱图；E、F为三级质谱图。图7 对照品42和色谱峰31的质谱图

注：A、B为一级质谱图；C、D为二级质谱图；E、F为三级质谱图。图8 对照品19和色谱峰13的质谱图

注：A、B为一级质谱图；C、D为二级质谱图；E、F为三级质谱图。图9 对照品30和色谱峰29的质谱图

在色谱峰14、16和17的质谱图中，均可以观察到准分子离子峰m/z303和加钠峰m/z325。通过中性丢失H2O、2H2O和2H2O+CO产生了碎片峰m/z285、267和239，推测A环至少含有3个羟基取代基，但均未检测到6B+碎片峰。由图1看出，所有的简单2-(2-苯乙基)色酮均含有相同的母核结构(C17O2Hy)，通过预测分子式和C17O2Hy之间C和H数量的差异可以推断取代基的类型。 因此，我们推断3个化合物均是含有3个羟基取代基，但无法判断其取代位置。3个色谱峰鉴定为trihydroxy-2-(2-phenethyl)-pentahydro-4H-chromen-4-one异构体。

注：A、B、C为一级质谱图；D、E、F为二级质谱图。图10 对照品26和色谱峰27、28的质谱图